酿造虾头虾壳功能性调味料用高产菌株选育研究

王常高，杜馨，林建国，赵泽鑫，蔡俊

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室，工业微生物湖北省重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068)

小龙虾，又称克氏原鳌虾或淡水小龙虾，不仅营养价值高，而且肉质鲜美、食用方式多样，深受广大消费者喜爱。近年来，小龙虾的养殖和消费量都呈现不断增长的趋势，使得小龙虾已经成为我国重要的经济养殖品种[1-3]。然而，目前小龙虾的可食用部分——虾尾蛋白仁仅占整个虾体重量的1/3，每食用或生产1吨的虾仁将产生2～3吨的虾头虾壳副产物。虾头虾壳副产物以前直接扔掉，不仅浪费资源，且造成环境的污染，之后逐渐开始加以利用，早期只是将其简单干燥粉碎后添加到各种饲料中，附加值不高[4]。后来利用酸碱等化学法从中提取甲壳素使其利用价值得到提升，但因新的环境污染而被限制使用[5]。

近年来，研究人员不断尝试利用各种发酵法、酶法、萃取法等生化方法来开发利用虾头虾壳中的各种有效成分，既可减少环境污染，又可使资源得到充分利用[6]。虾仁加工厂产生的虾头虾壳等副产物中含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、磷脂、虾青素、甲壳素、矿物质等多种营养性和功能性有效成份[7-11]。将虾仁加工厂余留的新鲜虾头虾壳作为原材料，利用酶解或微生物发酵作用，可用来制备各种新型调味料，不仅具有良好的营养和增鲜调味作用，而且具有一定的功能性作用[12-15]。为提高虾头虾壳中有效成分的利用率，本研究对虾头虾壳功能性酱油酿造用菌种——米曲霉(沪酿3.042)进行了多次诱变选育，以提高其在以虾头虾壳为主料的基质中的生长适应性和产酶水平。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

米曲霉(沪酿3.042)：本实验室保藏菌种。

1.1.2 虾头虾壳原料

潜江市熟制冷藏虾仁加工厂提供的烘干虾头虾壳粉碎产品(颗粒大小2～3 mm)，先用有机酸进行浸泡脱钙处理，洗涤抽滤后于冰箱中保藏备用。

1.1.3 培养基

斜面种子培养基：察氏酵母膏琼脂(CYA)。

初筛用酪素平板培养基：A：Na2HPO4·7H2O 1.1 g，干酪素4 g，KH2PO40.36 g，MgSO40.05 g，酪素水解液0.3 mL，水1000 mL，琼脂粉20 g；B：称取 BaCl25 g用牛皮纸包好。将A与B分开灭菌后，在无菌条件下趁热混匀，倒入无菌培养皿内制成平板，于121 ℃灭菌 20 min。

复筛用固体培养基：脱钙后的湿虾头虾壳粉90 g，麸皮10 g，水50 mL，于121 ℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬浮液制备

取保藏菌株接种于新鲜的斜面种子培养基，30 ℃培养3 d，取两环活化孢子于盛有玻璃珠和pH 7.0无菌磷酸缓冲液的三角瓶中，振荡20 min，得单孢子悬液。悬液用血球计数板计数，调整孢子悬液浓度为106个/mL左右。

1.2.2 诱变处理方法

紫外线(UV)诱变：各取孢子悬液15 mL放入5个90 mm无菌玻璃平皿中，在磁力搅拌作用下，用紫外灯(30 W，40 cm)取不同时间分别进行照射处理，绘制UV的致死曲线。选取75%左右致死率的时间再进行孢子悬液诱变处理，适当稀释后涂酪素平板。

硫酸二乙酯(DES)诱变处理：取经UV诱变筛选后所得变异菌株，用不同剂量的DES诱变处理，测定DES对变异菌株的诱变致死率，根据致死率选择合适的DES诱变剂量处理变异菌株的孢子悬液，加25% Na2S2O3溶液中止诱变反应，将处理后的悬液适当稀释后涂酪素平板。

1.2.3 变异菌株的筛选

酪素平板水解透明圈初筛法：将经过诱变处理后的孢子悬液进行不同程度稀释后涂布于酪素平板，30 ℃培养3 d，从中选取分离好、透明圈大且清晰、孢子致密的菌落，用无菌牙签取少量孢子再点种于酪素平板，30 ℃培养3 d，分别测定各个单菌落透明圈直径和菌落直径，计算 HC值。HC值=透明圈直径/菌落直径。选取HC值较大的菌株进行复筛。

固态发酵复筛法：将经过初筛后所得菌株的孢子悬浮液，分别接种于复筛固体培养基，摊开成1 cm的薄层在双层纱布上，于恒温恒湿培养箱中28 ℃、100%相对湿度(RH)条件下培养72 h，测定蛋白酶活力。选取蛋白酶活最高的菌株作为下一步诱变的出发菌株或作为生产菌株。

1.2.4 蛋白酶活力测定方法

采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。

准确称取鲜曲5 g加50 mL pH 7.2、0.2 mol/L磷酸缓冲液，将曲充分打散，于40 ℃水浴中恒温浸提1 h，用定性滤纸过滤，得酶液。酶液用磷酸缓冲液进行适当稀释后用Folin-酚法测其蛋白酶活，同时测定鲜曲水分含量。

蛋白酶活力单位定义：在40 ℃、pH 7.2条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 UV诱变结果

2.1.1 UV诱变致死曲线

将经过不同时间UV诱变处理后的孢子悬浮液适当稀释后涂布在CYA平板上，30 ℃培养3 d，根据平板上长出的菌落数与未经处理的平板上菌落数进行比较，计算各照射时间下的致死率，结果见图1。

图1 UV诱变致死曲线Fig.1 The lethality curve of UV mutation

一般认为，UV诱变在75%致死率时正突变率比较高。由图1可知，照射时间为120 s时，该菌株的UV诱变致死率(76%)在75%左右，所以后面的诱变时间采用120 s。

2.1.2 UV诱变初筛结果

将米曲霉孢子悬液用紫外线照射120 s后，涂布于酪素平板上，选取15株单菌落分离好、透明圈大且清晰的菌落再点种在酪素平板，培养后测得各菌落的HC值为：原种1.32、U-11.37、U-21.45、U-31.36、U-41.62、U-51.73、U-61.71、U-71.56、U-81.33、U-91.67、U-101.78、U-111.43、U-121.82、U-131.72、U-141.58、U-151.69。

由实验结果可知，挑选出的15株突变菌株的HC值都比出发菌株要大一些。为进一步验证其产酶水平，从中挑选HC值最大的U-5、U-10、U-12和U-13进行固态发酵产酶。

2.1.3 UV诱变复筛结果

将经过UV诱变初筛挑选出的4株突变菌株和原种分别接种到复筛固体培养基进行发酵产酶，用Folin-酚法检测其蛋白酶活，结果为：原种3128 U/g(干曲)、U-54836 U/g(干曲)、U-105261 U/g(干曲)、U-126749 U/g(干曲)、U-134904 U/g(干曲)。

由实验结果可知，蛋白酶活最高的是U-12，这与初筛的结果基本是一致的。选取U-12作为出发菌株进行后面的DES诱变处理。

2.2 DES诱变结果

2.2.1 DES诱变致死率

取U-12孢子悬液各10 mL，分别加入不同剂量的DES醇溶液，以配制成0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%不同的终浓度，充分振荡分散，于30 ℃振荡处理2 h，分别加入5 mL 25% Na2S2O3溶液中止诱变反应。将处理后的悬液适当稀释后涂CYA平板。与未经处理的U-12进行比较，根据平板上长出的菌落数计算出不同浓度下的致死率。结果为：0%的致死率0%，0.2%的致死率21%，0.4%的致死率58%，0.6%的致死率79%，0.8%的致死率93%，1.0%的致死率100%。

为防止U-12回复突变，同时为进一步提高其产酶水平，后面的诱变采用0.8%的高致死率剂量进行诱变处理。

2.2.2 DES诱变初筛结果

取U-12孢子悬液用0.8%的DES处理，适当稀释后涂布于酪素平板，培养后选取12株单菌落分离好、透明圈大且清晰的菌落再点种于酪素平板，培养后分别测得各菌落的HC值为：U-121.80、UD-11.88、UD-21.86、UD-31.94、UD-41.85、UD-52.54、UD-62.23、UD-72.76、UD-81.90、UD-91.97、UD-101.88、UD-112.48、UD-12。

根据实验结果，从中选取HC值最大的4株突变菌株UD-5、UD-6、UD-7、UD-11进行后面的固态发酵产酶复筛。

2.2.3 DES诱变复筛结果

将DES诱变初筛的4株突变菌株和U-12及原种的孢子悬液分别接种到复筛固体培养基进行发酵产酶，用Folin-酚法分别检测其蛋白酶活，结果为：原种3436 U/g(干曲)、U-126693 U/g(干曲)、UD-59752 U/g(干曲)、UD-68920 U/g(干曲)、UD-711059 U/g(干曲)、UD-119327 U/g(干曲)。

由实验结果可知，UD-7的蛋白酶活最高，干基酶活达到11059 U/g，比U-12和原种的蛋白酶活都有显著提高。故后面选取UD-7突变菌株进行制曲及酿造工艺条件的优化实验研究。

2.3 UD-7遗传稳定性实验

将UD-7共进行7次试管斜面传代培养，每传代一次，将其孢子悬液接种至复筛固体培养基进行固态发酵产酶，用Folin-酚法分别检测其蛋白酶活，结果为：第Ⅰ代11210 U/g(干曲)、第Ⅱ代11078 U/g(干曲)、第Ⅲ代11432 U/g(干曲)、第Ⅳ代10986 U/g(干曲)、第Ⅴ代11105 U/g(干曲)、第Ⅵ代11350 U/g(干曲)、第Ⅶ代11097 U/g(干曲)。

由实验结果可知，经过7次传代培养，UD-7的蛋白酶活水平都能保持在11000 U/g左右，没有太大的变化，说明UD-7具有较好的遗传稳定性，这为后面的进一步研究及今后的工业化生产打下了良好的基础。

3 结论

米曲霉(沪酿3.042)是我国酱油生产中广泛应用的最经典生产菌种，在以豆粕、花生粕、麸皮等植物性蛋白为主要原料的基质上生长良好，产蛋白酶活水平高，生产转化率高，酱油产品鲜香味浓郁[16-18]。本项目研究发现，米曲霉在以虾头虾壳粉等动物性蛋白为主要原料的基质上长势不太好，产蛋白酶活水平也不太高。为使该菌株适应虾头虾壳粉等动物性蛋白生长环境，提高其产蛋白酶活水平，从而提高原料中蛋白质等有效成分的转化利用率，先对米曲霉菌种进行了多轮的诱变选育。

通过UV诱变，得到了一株蛋白酶活较高的突变菌株U-12，其在以虾头虾壳粉为主要原料的固体培养基上的蛋白酶产酶水平达到了6749 U/g(干曲)，比出发菌株沪酿3.042(3128 U/g)提高了116%。在U-12的基础上再通过DES诱变，得到了一株蛋白酶活最高的突变菌株UD-7，其在以虾头虾壳粉为主要原料的固体培养基上的蛋白酶产酶水平达到11059 U/g(干曲)，比U-12(6693 U/g)提高了65%，比出发菌株沪酿3.042(3436 U/g)提高了222%。通过7次传代培养和固态发酵产酶，其产蛋白酶活水平变化幅度不大，说明其具有较好的遗传稳定性，这为后面的制曲和酿造研究过程打下了良好的基础。