口蹄疫A 型抗体检测试剂盒的筛选

刘起涛 郭天准 杜季梅 郭占达

1.申联生物医药（上海）股份有限公司 200241

2.河南农业大学动物疫病检测中心 450002

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是一种高度传染的病毒性动物疫病，具有重大的政治经济影响力，该病可感染偶蹄动物，包括猪、牛、绵羊和70 多种野生动物，也能感染一些非偶蹄类动物，如老鼠和大象。口蹄疫的发病特点是发热、厌食、口腔和蹄部出现水泡等症状，也可能出现长期无症状感染而散毒的情况。根据口蹄疫病毒结构蛋白抗原性的差异，将口蹄疫病毒分为7 个血清型，分别是：O 型、A型、C 型、南非1 型（SAT-1）、南非2 型（SAT-2）、南非3型（SAT-3）和亚洲1 型（Asia 1），每个血清型还有一系列的血清亚型，不同血清型的口蹄疫病毒引起的临床症状几乎相同。控制和根除口蹄疫成本高昂且操作困难，大多数国家采取疫苗免疫的控制策略。我国从2001 年开始口蹄疫疫苗的强制免疫，猪口蹄疫O 型疫苗已免疫接种近20 年，猪群中口蹄疫O 型抗体水平保持较好水平。农业农村部《2018年国家动物疫病强制免疫计划》中规定“各省根据评估结果自行确定是否对猪 A 型口蹄疫实施免疫”的免疫计划。鉴于此，一些省份从2018 年开始对猪进行A 型口蹄疫疫苗的免疫接种，猪免疫口蹄疫疫苗之后28d 采集血清样品进行免疫效果评估，选用稳定可靠的猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体检测试剂盒是评价疫苗免疫效果的关键所在。

本项研究从某省免疫猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）的9 个规模化猪场，每场采集10 份血样，共采集90 份血清样品。血清样品分别用购买的3 种不同厂家生产的猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体ELISA 检测试剂盒（简称试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C），检测猪口蹄疫病毒A 型抗体。本研究旨在比较市面上销售的猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体ELISA 检测试剂盒的检测效果，筛选出能够有效检测免疫接种猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）后A 型抗体的猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体的检测试剂盒，进而为评估猪群口蹄疫A 型抗体水平提供较好的检测试剂盒参考。

1 材料和方法

1.1 仪器1510-03051 型全波长酶标仪购自Thermo 公司，THZ-98A 型恒振荡器购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 材料

1.2.1 试验疫苗猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13），国内某口蹄疫疫苗生产企业生产，批号：20191204。

1.2.2 血清样品从某省免疫接种猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）的9 个规模化猪场，每场采集10 份血样，共采集90 份血样（样品编号为1-10、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、81-90）。

1.2.3 检测试剂猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体ELISA 检测试剂盒，试剂盒A，某生物技术有限公司生产，批号：20 200801；试剂盒B，某生物科技有限公司生产，批号：614201110A；试剂盒C，某科技有限公司生产，批号：200401。

1.3 方法

1.3.1 疫苗免疫接种选取60 日龄育肥猪，耳根后深层肌肉注射猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13），每头猪注射1mL。

1.3.2 血清样品收集88 日龄时采用前腔静脉采血方式采集血样，采集的90 份血样用低速冷冻离心机4℃、3000rpm离心5 分钟，分离出血清，2～8℃冷藏保存。

1.3.3 抗体检测使用3 种猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体ELISA 检测试剂盒分别进行抗体检测，检测结果按照相应说明书标准进行判定。

2 结果与分析

2.1 试剂盒检测结果比较

2.1.1 试剂盒检测抗体合格率3 种试剂盒的检测结果见图1，试剂盒A 和B 检测的猪口蹄疫A 型抗体合格率分别为93.33%（84/90）、87.78%（79/90），试剂盒A 和B 检测的抗体合格率基本一致，二者的敏感性较高。试剂盒C 检测的猪口蹄疫A 型抗体合格率仅为25.56%（23/90），抗体合格率低，明显低于试剂盒A 和B 的检测结果。试剂盒C 敏感性较低可能是抗原反应板中包被的抗原种类与疫苗抗原不同有关。

图1 三种试剂盒检测的猪口蹄疫A 型抗体合格率

2.1.2 试剂盒检测符合率90 份血清样品用3 种试剂盒检测，试剂盒A 与B 检测均为阳性的血清有79 份、均为阴性的血清有6 份，试剂盒A 检测为阳性而试剂盒B 检测为阴性的血清有5 份，即试剂盒A 与B 检测结果相同的血清有85 份、检测结果不同的血清有5份，二者的符合率为94.44%（85/90）；试剂盒A 与C 检测均为阳性的血清有23 份、均为阴性的血清有6 份，试剂盒A 检测为阳性而试剂盒C 检测为阴性的血清有61 份，即试剂盒A 与C 检测结果相同的血清有29 份、检测结果不同的血清有61 份，二者的符合率为32.22%（29/90）；试剂盒B 与C 检测均为阳性的血清有23 份、均为阴性的血清有11 份，试剂盒B 检测为阳性而试剂盒C 检测为阴性的血清有56 份，即试剂盒A 与C 检测结果相同的血清有34 份、检测结果不同的血清有56 份，二者的符合率为37.78%（34/90）。试剂盒A 与B 的检测符合率较高，试剂盒A、B 与试剂盒C 的检测符合率较低。

2.2 猪群中口蹄疫A 型抗体情况9 个规模化猪场（场1～场9）的采样猪群抗体合格率见表1。根据试剂盒A 与B 的检测结果可以看出，场1、3、5、6、7、8、9 免疫后28d 抗体合格率均达到100%（10/10），猪群抗体水平高、疫苗免疫效果较好；场2 的A 型抗体合格率未达到国家标准（70%以上）要求，需采取补免措施提高猪群抗体水平；场4 的A 型抗体合格率较好，个别猪只抗体不合格，需定期监测猪群口蹄疫A 型抗体水平，发现口蹄疫抗体合格低时及时做好猪群口蹄疫疫苗的加强免疫。

表1 猪场口蹄疫A 型抗体合格率

3 结论与讨论

口蹄疫是一种严重危害畜牧业健康发展的高度传染性的动物疫病，我国从2001 年开始对猪进行口蹄疫O 型疫苗的强制免疫，检测口蹄疫病毒O 型抗体的试剂盒种类和方法已经成熟。2018 年开始，一些省份开始对猪进行口蹄疫A 型疫苗的强制免疫，疫苗免疫后与之配套的猪口蹄疫A 型抗体检测试剂盒尚处于开发研究阶段。

本研究分析比较3 种检测试剂盒的检测效果。试剂盒A 与B 检测的A 型抗体合格率分别为93.33%、87.78%，与李伟等检测的首免猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗后30d；杨虹等检测的免疫接种猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗后28dA 型抗体合格率一致。试剂盒A 与B 检测结果的符合率较高，表明这两种试剂盒可用于猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗免疫效果评估。试剂盒C 检测的A 型抗体合格率仅为25.56%，与试剂盒A 和B 的检测符合率较低，不适用于猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗免疫效果评价，这可能与抗原反应板包被的VP1 结构蛋白特异性抗原有关。猪口蹄疫O 型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）含有2 个O 型抗原、1 个A 型抗原，免疫接种后O 型抗原对猪只产生的免疫反应比A 型抗原更强烈。因此，7 个猪场猪群中A 型抗体合格率较高，也意味着猪群O 型抗体合格率较好。9 个规模猪场中场1、3、5、6、7、8、9 免疫后28d 抗体合格率达到100%，表明这7 个猪场猪群口蹄疫疫苗免疫效果较好，猪群的抗体整齐度较高，能为育肥猪生长周期内提供抗口蹄疫感染的良好保护。场2 检测的A型抗体合格率低于国家标准，一方面的原因可能与疫苗注射时操作不当导致进入猪体颈部深层肌肉的疫苗量不够；另一方面的原因可能是存在母源抗体干扰，导致免疫后一部分疫苗抗原被猪体内的母源抗体中和，两种原因导致刺激猪只产生的免疫反应需要的抗原量不足，猪体产生的抗体水平较低。

本研究通过3 种不同的猪口蹄疫病毒A 型VP1 结构蛋白抗体的检测试剂盒对免疫28d 后的血清样品进行猪口蹄疫病毒A 型抗体的检测，筛选出2 种能够用于评估猪口蹄疫O型、A 型二价合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）免疫效果的试剂盒，对猪场进行口蹄疫病毒A 型抗体的免疫效果评价提供了检测试剂盒的参考。