复合石油降解菌的构建及其降解石油效果的探究

鄢雨朦，付保荣

(辽宁大学 环境学院，辽宁 沈阳 110036)

1 引言

现在，生物修复技术已变成对生态环境进行保护过程中的一类最有价值的修复手段[1]，石油污染土壤的生物修复不仅可以有效地降解石油，而且可以有效地降低修复石油污染土壤时带来的生物入侵风险。利用微生物进行石油污染土壤的修复拥有操作便捷、成本低、无二次污染、不损害土壤构造等优势[2,3]。自然环境中很多微生物，能够只把石油烃当作碳源和能源，借助氧化、脱氢等可以发生在细胞内、外的通过酶促进的反应，从而将石油烃降解成水、二氧化碳和其他代谢产物[4,5]。这类微生物有种别多、遍布范围广、繁殖快、个体小、比表面积大和易变异的特征，这使其在修复被石油污染土壤的时候体现出效率高且多样的性质。微生物对石油烃污染物的降解取决于石油烃污染物的量、状况、环境条件以及微生物群落构成[6]。

本文研究了两株石油降解菌进行组合后降解石油的效果，将筛选出的两株石油降解菌2#、3#进行复配，构建复合石油降解菌。将复合石油降解菌应用在石油污染控制中，不仅能够高效治理石油污染的环境，还为石油降解菌进一步修复石油污染土壤提供了依据。

2 实验材料

2.1 培养基

(1)石油无机盐培养基：K2HPO46 g，KH2PO46 g，(NH4)2SO46 g，NaCl 5 g，石油1 g，pH值为7.0，蒸馏水1000 mL。固体培养基在此基础上加入琼脂15～20 g即可。

(2)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值为7. 0～7.2，121 ℃灭菌20 min。固体培养基在此基础上加入琼脂15～20 g即可。

2.2 实验试剂

石油、石油醚。

2.3 实验所需菌株

前期实验富集分离纯化得到的石油降解菌2#和3#。

2.4 主要仪器设备

探究过程主要使用的仪器设备见表1。

表1 主要实验仪器设备

3 复合石油降解菌的构建及其对石油降解情况的探究

3.1 复合石油降解菌的构建

首先，将在4 ℃冰箱中存留的菌种培养基在35 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，在洁净工作台上先用酒精灯外焰对接种环灭菌，等其冷却后挑取试管内单一完整的菌落，分别转接到平板固体培养基上，在35 ℃恒温培养箱中培养24 h。分别取一环活化的单菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于条件设置为35 ℃、转速150 r/min的恒温摇床中振荡培养24 h，使菌株大量生长。将通过上述过程得到的单菌株菌液分别以1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2的比例混合制备得到混合菌株菌液，构建降解石油的复合菌(图1)。

3.2 复合石油降解菌对石油降解情况的探究

将2.5 mL(体积分数为5%)混合菌株的菌液接入50 mL石油无机盐培养液，将不接菌液的培养基作为空白对照。其培养与条件设置为35 ℃、150 r/min的恒温摇床中培养6 d。每组样品做3个平行样。

在取出的培养液中加入石油醚进行萃取，并将萃取液在5000 r/min的条件下进行离心10 min，转入分液漏斗，静置分层，收集上清液。反复三次用石油醚洗涤，合并上层萃取液。加入2 g无水Na2SO4过滤，随即装入10 mL容量瓶中，用石油醚定容到刻度线。之后采用紫外分光光度法测定石油降解率[7]，利用紫外-可见分光光度计在254 nm波长处依次对萃取液进行吸光度值的测定，以石油醚为空白。经由标准曲线计算石油的剩余量，并借助下述公式计算得出菌株的石油降解率。

单菌株在菌群中所占比例及不同比例的单菌构成的复合菌降解石油的效率如表2所示。

表2 复合菌的石油降解率

图1 菌株投加比例对菌株降解率的影响

通过表2可以看出，五组复合石油降解菌培养6 d后的石油降解率分别为35.09%、40.08%、55.03%、62.66%、52.88%。实验得出菌株的最佳复配比为2∶3，此时复合石油降解菌的石油降解率可达到62.66%。前期实验得出2#菌株降解石油的效率为21.99%、3#菌株降解石油的效率为30.2%，相比于单菌株石油降解率，复合菌降解石油的效率分别提高了约40.67%、32.46%。实验结果表明复配后的菌株对石油烃的降解效果均优于单菌株，能够较好的进行石油的降解，为后续菌株降解石油的应用提供指导。

4 结语

实验得出菌株的最佳复配比为2∶3，此时复合石油降解菌的石油降解率可达到62.66%，相比于单菌株石油降解率，复合菌降解石油的效率提高了约32.46%。实验结果表明复配后的菌株对石油烃的降解效果均优于单菌株，其不仅能够用来治理石油污染的环境，还能够为石油降解菌进一步运用在修复石油污染土壤中提供依据。