长链非编码RNA JPX对鼻咽癌增殖和侵袭的影响及机制研究*

张余良， 杨 杰， 刘术舟， 周安燕

海南省人民医院，海南医学院附属海南医院 1耳鼻咽喉头颈外科 2呼吸与危重症医学科，海口 570311

鼻咽癌是头颈部常见的恶性肿瘤，高发于南方省份[1]。鼻咽癌起病隐匿，早期诊断缺乏特异性，多数患者确诊时已处于中晚期[2]。尽管鼻咽癌对放疗敏感，鉴于其高度恶性程度和诊断时处于中晚期，鼻咽癌患者预后仍不佳，临床报道中晚期鼻咽癌患者5年生存率低于50%[3-4]。因此，深入探讨鼻咽癌进展的分子机制对发现新的治疗靶点和改善预后意义重大[5]。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)不能编码蛋白质分子，是一种新的肿瘤调控因子，在细胞增殖﹑表观遗传调控及转录等生物学过程中起重要作用[6-7]。lncRNA JPX是X染色体失活的分子开关[8]，其异常表达与肺癌[9]和肝细胞癌[10]的进展及预后有关。lncRNA JPX在鼻咽癌中的表达及作用尚不清楚。本研究旨在检测lncRNA JPX在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞增殖及侵袭的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人鼻咽上皮细胞系NP69及鼻咽癌细胞系(6-10B、5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2、HNE-1、HONE-1)均来源于本实验室保存的细胞系。细胞培养所采用的RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司、蛋白印迹试剂盒购自武汉博士德生物科技公司、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司、LipofectamineTM3000转染系统购自美国Invitrogen公司、Transwell小室购自美国Corning公司、si-lncRNA JPX及si-NC序列由美国Invitrogen公司设计合成。

1.2 实验方法

1.2.1 实时定量PCR检测lncRNA JPX的相对表达水平 对鼻咽癌及人鼻咽上皮细胞系提取总RNA后，采用实时定量PCR测定lncRNA JPX的相对表达量，反应条件为：95 ℃15 min；95 ℃30 s、60 ℃60 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。lncRNA JPX PCR引物序列，正向：5′-GTCTTGGTGCTCTGTGTTC-3′，逆向：5′-CCCGTTATTCTGTCCTTCT-3′；GAPDH引物序列，正向：5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，逆向：5′-GCTGATGATCTYGAGGCTGTGTTGTC-3′。按2-ΔΔCt法计算上述细胞系中lncRNA JPX的表达水平。

1.2.2 细胞干扰及对照序列 lncRNA JPX干扰RNA(si-lncRNA JPX)及阴性对照(si-NC)序列由上海吉玛公司合成。si-lncRNA JPX上游序列：5′-GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3′；下游序列：5′-UAGCAGCAACGGAGAAGCTT-3′。si-NC上游序列：5′-UUCUCCGAACGUGUGUCACGUT-T-3′；下游序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAG-AATT-3′。

1.2.3 细胞分组 采用LipfectamineTM3000转染试剂盒对鼻咽癌细胞系HONE-1分别转染si-lncRNA JPX序列、si-NC序列，并分成lncRNA JPX沉默表达组(si-lncRNA JPX组)、阴性对照组(si-NC组)，空白对照组为NC组，将3组细胞培养48 h后收集细胞，提取总RNA并逆转录为cDNA，RT-PCR检测各组转染效率。

1.2.4 细胞增殖实验 采用MTT法测定细胞增殖能力，将对数生长期细胞系HONE-1接种于96孔板，浓度为1×103个/孔，培养24、48、72及96 h后，加入MTT液20 μL，然后再培养4 h，上酶标仪，在450 nm波长下测定A450 nm值，并制作细胞增殖曲线。

1.2.5 Transwell实验测定细胞侵袭能力 简要步骤如下：在Transwell小室上室中分别加入si-lncRNA JPX组、si-NC组及NC组细胞，细胞密度均为1×105个细胞/孔，在小室下室加入RPMI-1640培养液200 μL，经室温培养24 h后，取出小室，并将穿膜细胞用甲醛固定后苏木精染色，拭去未穿膜的细胞后，计数穿膜细胞数，在200倍视野下随机计数20个视野，计算平均数。

1.2.6 蛋白印迹实验检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达 提取组织或细胞系的总蛋白后，以30 μg蛋白经10%SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳完后转膜至PVDF膜，加Wnt、β-catenin一抗(1∶200)、鼠抗人GADPH单抗(1∶300)，室温孵育2 h，漂洗3次后，加HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶500)，孵育1 h，暗室下加入ECL发光液后曝光显影，记录蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 鼻咽癌细胞系中lncRNA JPX表达水平比较

qRT-PCR结果示，鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2、5-8F、6-10B、C666-1、HNE-1、HONE-1中lncRNA JPX相对表达量高于NP69细胞系(均P<0.05)， 由于lncRNA JPX在HONE-1细胞系中相对表达量最高，后续实验在HONE-1细胞系中进行，见图1。

与NP69细胞系比较，*P<0.05

2.2 沉默lncRNA JPX表达抑制鼻咽癌细胞增殖

qRT-PCR示，HONE-1细胞转染si-lncRNA JPX后，si-lncRNA JPX组lncRNA JPX相对表达量为2.03±0.15，si-NC组lncRNA JPX相对表达量为10.12±0.45，NC组lncRNA JPX相对表达量为10.42±0.69，si-lncRNA JPX组lncRNA JPX相对表达量低于si-NC组和NC组(均P<0.01)，提示lncRNA JPX表达沉默成功，见图2A。MTT示，转染24 h，si-lncRNA JPX组、si-NC组及NC组A450 nm值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；转染48 h，si-lncRNA JPX组A450 nm值低于si-NC组(0.48±0.04)vs.(0.90±0.09，P<0.05)；转染72 h，si-lncRNA JPX组A450 nm值低于si-NC组(0.75±0.05)vs.(1.42±0.06，P<0.05)；转染96 h，si-lncRNA JPX组A450 nm值低于si-NC组(0.95±0.04)vs.(1.67±0.05，P<0.05)，上述研究结果提示沉默lncRNA JPX表达后，细胞增殖能力受到抑制，见图2B。

A：lncRNA JPX沉默效率测定；B：细胞增殖曲线；与si-lncRNA JPX组比较*P<0.05，**P<0.01

2.3 沉默lncRNA JPX表达抑制鼻咽癌细胞侵袭

Transwell侵袭实验显示：si-lncRNA JPX组侵袭细胞数少于si-NC组(51.0±5.8vs.102.0±7.3，P<0.05)，si-lncRNA JPX组侵袭细胞数少于NC组(51.0±5.8vs.100.5±5.1，P<0.05)，而si-NC组和NC组间侵袭细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

A：3组Transwell实验；B：3组侵袭细胞数比较;*P<0.05

2.4 沉默lncRNA JPX表达对鼻咽癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

Western blot检测结果显示，沉默lncRNA JPX表达后，si-lncRNA JPX组Wnt1蛋白相对表达量低于si-NC组(0.19±0.01vs.1.02±0.02，P<0.05)，而si-NC组与NC组差异无统计学意义(P>0.05)，si-lncRNA JPX组β-catenin蛋白相对表达量低于si-NC组(0.28±0.04vs.1.03±0.03，P<0.05)，而si-NC组与NC组差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

A：3组Wnt 1及β-catenin蛋白相对表达量比较；B：Western blot示3组Wnt 1及β-catenin蛋白表达;① si-lncRNA JPX组,② si-NC组,③ NC组;**P<0.01

3 讨论

鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首，且主要分布于南方地区，具有明显的地域性和种族性[11-12]。鼻咽癌常表现为鼻塞、听力下降等症状，早期不容易发现[13]。放化疗同步治疗是鼻咽癌的首选治疗方法[14]。局部复发或远处转移是导致鼻咽癌患者预后不佳的重要原因[15]。

lncRNA JPX是XIST基因的激活剂，是X染色体失活的分子开关，基因定位于X染色体长臂上的12位点。文献报道它可以正向调节XIST的表达，参与X染色体失活[16]。XIST的异常表达与调节不同类型肿瘤细胞的迁移和转移有关，其在肿瘤进展中发挥致癌作用[17-18]。尽管已证实lncRNA JPX在肺癌、结直肠癌、肝细胞癌和卵巢癌均表达上调，同时研究显示其是卵巢癌患者不良预后的预测分子，且其可激活PI3K/Akt/mTOR通路而促进体外培养的卵巢癌细胞迁移和侵袭过程[19]。在非小细胞肺癌中，lncRNA JPX高表达可通过下调miR-33a-5p表达进而激活Twist1表达而促进肿瘤细胞的侵袭和转移[20]。在宫颈癌中[21]，lncRNA JPX可通过激活miR-25-3p并调节SOX4基因表达而促进宫颈癌细胞侵袭和转移。

实时定量RT-PCR显示lncRNA JPX在鼻咽癌细胞系中表达上调，且上调幅度不一，可能与癌细胞系的不同生物学特性有关。文献报道lncRNA JPX在非小细胞肺癌的癌组织中表达水平较非癌组织显著上调，且lncRNA JPX高表达患者总生存率显著低于lncRNA JPX低表达患者，lncRNA JPX表达是非小细胞肺癌患者预后不良的重要预测因素和分子标志物,与上述结果一致[9]。

本研究设计合成lncRNA JPX的干扰RNA序列和对照序列转染至HONE-1细胞系中，实时定量RT-PCR检测发现si-lncRNA JPX可显著敲低lncRNA JPX表达。采用MTT法检测下调lncRNA JPX表达对HONE-1细胞系增殖的影响，实验结果显示，下调lncRNA JPX表达可显著抑制HONE-1细胞增殖。Transwell侵袭实验显示，下调lncRNA JPX表达后HONE-1细胞系的穿膜细胞数少于阴性对照组，提示下调lncRNA JPX表达可抑制鼻咽癌细胞转移。最近研究显示在非小细胞肺癌中[20]下调lncRNA JPX表达可显著抑制细胞系(SPC-A-1，LTEP-a-2，A549，NCI-H1299)的细胞增殖和侵袭过程，与上述结果一致。在宫颈癌中也发现类似结果，下调lncRNA JPX表达可显著抑制体外培养的宫颈癌细胞的增殖袭过程[21]。

Wnt/β-catenin信号通路是癌细胞发生癌变和促进癌细胞恶性增殖的重要信号通路，在正常细胞中其处于低水平表达状态，细胞发生癌变时其过度激活并可导致细胞不受限制的恶性增殖，是癌症治疗潜在靶点之一[22-23]。本研究发现下调lncRNA JPX表达对细胞系中Wnt/β-catenin信号通路的影响，结果发现敲低lncRNA JPX后可显著抑制Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白Wnt1和β-catenin的表达，从而抑制鼻咽癌细胞的转移。Wnt/β-catenin信号通路过度活化可促进肿瘤细胞恶性进展，导致肿瘤细胞易转移至身体其他部位，增加治疗困难度同时恶化患者的预后[24]。在鼻咽癌细胞中敲低lncRNA JPX抑制Wnt/β-catenin信号通路激活而抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。

综上，鼻咽癌组织和细胞系中lncRNA JPX表达上调，而下调lncRNA JPX表达可抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的抑制有关，下调lncRNA JPX表达可能成为鼻咽癌治疗的一个新的潜在治疗靶点。