基于显微光谱法的双壳类海洋生物中微塑料的检测方法研究

贺雨田，杨 颉，隋海霞，杜振霞*，宋 雁

（1．北京化工大学 化学学院，北京 100029；2．国家食品安全风险评估中心，北京 100022）

微塑料通常指粒径小于5 mm的塑料纤维、薄膜或颗粒［1］，按形成方式可分为初级微塑料和次级微塑料。据统计，每年全球塑料产量超过1亿吨，9%～21%的塑料废物被回收或焚烧，其余的塑料垃圾经填埋或随意排放在环境中，成为微塑料的重要来源。微塑料在自然环境中广泛存在，据报道，在水［2－3］、土壤［4－5］、空气［6－7］、生物体［8－9］、饮用水［10］、茶包［11］等介质中都检出了微塑料。2019年的监测结果表明，中国海洋表层水体漂浮垃圾平均个数为4 027个/平方千米。受塑料自身结构和性质的影响，微塑料在自然环境中难以降解，并且由于具有高疏水性和较高的比表面积，其表面易吸附周围环境污染物和病原体，甚至可能通过食物链传递、富集，对生态系统构成威胁，产生的环境污染与毒害问题不容小觑［12－16］。近年来，国内外对微塑料的研究越来越重视。2014年的首届联合国环境大会上，海洋中的塑料垃圾问题被列入“十大紧迫环境问题”，并对微塑料提出了特别关注；2016年第二届联合国环境大会决议指出，塑料碎片对海洋环境和生物多样性造成极大损害；2020年7月，九部委联合印发《关于扎实推进塑料污染治理工作的通知》，明确规定了塑料制品的使用和处理的禁限期限。

目前，根据粒径大小，可将对微塑料检测方法的研究分为对纳米级别的微塑料（纳米塑料）和微米级别的微塑料的研究。对于纳米级微塑料，常使用拉曼镊子［17］、扫描电镜［11］和热解/气相色谱－质谱［18］等方法进行研究，如茶包浸出液［11］、回收塑料［19］释放出的纳米颗粒等。对微米级的微塑料，主要使用光谱法［20－22］、染色法［23－25］、质谱法［18］和扫描电镜［11］等方法进行研究。此外，关于微塑料的研究还包括微塑料的前处理方式［26］等方面。报道中对微塑料的研究很多，但缺乏从前处理到检测等系统性的研究。本研究以贻贝（评估海洋微塑料污染的生物）为例，从整体出发，对微塑料前处理方式、滤膜选择和光谱检测方法等进行研究，探究了双壳类海洋生物中微塑料的检测方法。

1 材料与方法

1.1 样品、试剂与仪器

2 mm×3 mm微塑料（聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene glycol terephthalate，PET，农夫山泉瓶）；聚酰胺（Polyamide，PA，茶包）；聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC，文件袋）；聚苯乙烯（Polystyrene，PS，刷子把）；聚丙烯（Polypropylene，PP，萝卜汁瓶）；高密度聚乙烯（High density polyethylene，HDPE，酸奶瓶）），50～1 000μm微塑料（PP/PA/PS/PET/PVC/HDPE，中联塑化科技有限公司）。贻贝（周边商场，购置后用铝箔纸包裹并于-20℃下保存）。

胰蛋白酶（1∶250）、硝酸（69%）、盐酸、氢氧化钾、双氧水（30%）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，实验用水为超纯水。混合纤维素滤膜（MCE，3μm，47 mm，上海兴亚净化材料厂），聚四氟乙烯滤膜（PTFE，3μm，47 mm，天津市津腾实验设备有限公司）。

超纯水系统（Milli-Q Advantage A10，Merck Drugs&Biotechnology），隔膜真空泵（GM-0．33A）、玻璃抽滤装置（天津津腾试验设备公司），电子天平（CP225D，Sartorius公司），真空干燥箱（DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司）。

傅里叶变换红外显微成像系统（Thermo Scientific Nicolet 8700）：测量模式为显微全反射（ATR）和普通ATR模式，光谱范围4 000～500 cm－1，扫描次数16次，光谱分辨率8 cm－1，空间分辨率10μm。显微共焦激光拉曼光谱仪（Renishaw in Via）：扫描模式extended，激发光源785 nm，光栅1 200 l/mm，Renishaw 1024 CCD探测器，光谱范围3 200～100 cm－1，曝光时间10 s，累计次数1次。

1.2 质量控制

为避免环境中带来的污染，整个实验过程均在通风橱中进行，实验人员穿白色棉质工作服并佩戴丁腈手套；所有器皿在使用前均用超纯水清洗3次。

1.3 消解条件考察

1.3.1 消解试剂选择 将贻贝（3～4个）解冻，搅碎并置于干燥箱中60℃下干燥，称取4份0．3 g肉沫分别置于4个烧杯（50 mL）中，依次加入20 mL硝酸（69%）、氢氧化钾（10%）、双氧水（30%）以及胰蛋白酶溶液（2 mg/mL），并根据表1中的条件进行消解，每组平行3次。

表1 不同消解试剂的消解方式Table 1 The digestion method of different digestion reagents

消解后，将双氧水、胰蛋白酶溶液、氢氧化钾（先用盐酸（10%）中和至pH 7．0）用混合纤维素滤膜（3μm）过滤；硝酸用聚四氟乙烯滤膜（3μm）过滤。过滤时为防止生物组织附着在器壁上，用2 mL超纯水分别清洗烧杯和过滤器3次。其后用表面皿半遮盖滤膜，使其自然风干4 h，之后每0．5 h称重一次，待两次恒重后记录数据。

消解效率通过过滤前后滤膜质量的变化与最初贻贝肉的质量比计算：

η：消解效率；Ma：滤膜初始质量；Mb：使用并干燥后的滤膜质量；Mc：初始贻贝肉质量。

1.3.2 消解时间优化 使用氢氧化钾（10%）溶液，在40℃下对0．3 g贻贝肉进行水浴消解，消解时间分别为6、9、12、24、36、48 h，每组平行3次，消解后采用“1．3．1”方法处理，计算消解效率。

1.3.3 不同种类双壳类生物的消解 选择青蛤、白蛤、文蛤、花甲和青口贝5种不同的双壳类生物在最佳消解条件下进行消解，消解后采用“1．3．1”方法处理，计算消解效率。

1.4 消解试剂对微塑料的影响

选择2 mm×3 mm的PP、PA、PS、PET、PVC、HDPE微塑料，称重并采集其初始红外和拉曼光谱数据，随后分别用硝酸（69%）、氢氧化钾（10%）和双氧水（30%）溶液在表1条件下进行消解。消解后，称重并采集红外、拉曼光谱数据。

1.5 光谱检测

为了确证分析方法的可靠性，制备了阳性模拟样品：将冰箱中3～4个贻贝解冻后搅碎并置于干燥箱中（60℃）干燥，称取0．3 g肉沫置于烧杯（50 mL）中并添加上述6种微塑料共计30个颗粒（20～1 000μm），磁力搅拌使肉沫和微塑料混匀后加入20 mL氢氧化钾（10%）溶液，在40℃下水浴36 h。随后使用混合纤维素滤膜（3μm）过滤，过滤时用2 mL去离子水清洗烧杯和过滤器各3次，避免微塑料附着在玻璃器壁上。干燥后用红外和拉曼光谱仪进行定性定量检测和微塑料粒径考察，并计算回收率，每组平行3次。

1.6 回收率考察

借助红外（或拉曼）仪器的显微镜观察寻找微塑料，采集其光谱数据以确定是否为添加的微塑料颗粒，并通过计数的方式计算其回收率。

1.7 典型样品检测

选择青蛤、文蛤、白蛤、花甲和青口贝5种不同种类的双壳类生物，使用氢氧化钾（10%）在40℃下消解36 h，消解后采用“1．3．1”方法处理，使用显微拉曼进行定性定量检测。

2 结果与讨论

2.1 消解条件的确定

介质包覆问题是海产品中微塑料检测的关键，通常的解决方法是对包覆微塑料的介质进行消解。结合文献，选取胰蛋白酶（2 mg/mL）溶液、氢氧化钾（10%）、双氧水（30%）以及硝酸（69%）为消解试剂进行考察。其中，氢氧化钾已广泛应用于浮游生物、鱼类、牡蛎等海洋生物的样品前处理［27］，具有对微塑料影响小且消解效率高的特点。Thiele等也明确氢氧化钾适用于双壳类生物的消解，并确定在40℃下消解最佳［27］。因此，根据文献结果确定了相应的消解条件，见表1。在表1的消解条件下，上述4种试剂的消解效率依次为（72．11±2）%、（97．86±2）%、（56．54±2）%、（96．97±2）%。氢氧化钾（10%）的消解效率最好，硝酸次之。酶虽然对微塑料不产生影响，但其消解效率较低。室温下双氧水的消解效率低且对微塑料有一定影响，高温下使用双氧水消解时对微塑料影响过大［28］。由于使用硝酸消解后，PA被完全溶解，PET和PVC质量明显增加，PET形变弯曲且所有微塑料表现为不同程度的泛黄（图1）；而使用氢氧化钾（10%）消解后微塑料的质量及其红外和拉曼光谱基本不变，不影响微塑料的定性定量检测。因此，采用氢氧化钾（10%）对双壳类海洋生物进行消解。

图1 硝酸消解前（A）后（B）微塑料的变化Fig．1 Changes of microplastics before（A）and after（B）digestion by nitric acid

实验发现，采用氢氧化钾（10%）在40℃下水浴消解36 h后，消解效率趋于平稳，因此选择氢氧化钾（10%）于40℃下消解36 h。该条件下5种双壳类生物的消解效率均高于97%，证实了消解方法的适用性。

2.2 过滤膜的选择

金属膜、氧化铝膜或添加金属镀层的滤膜表面平整、不易弯曲变形且不产生红外和拉曼谱线干扰，可用于拉曼和红外光谱测定。但金属膜和氧化铝膜成本昂贵，添加金属镀层的滤膜需使用相应设备进行制备，难以作为常规用膜。进行光谱检测时，普通滤膜因反光透光能力弱，在红外光谱中的噪音干扰大，不适用于反射和透射模式的检测；而玻璃纤维素、混合纤维素、不锈钢筛网的拉曼光谱背景谱线较为平整［29］，可用于红外全反射（ATR）模式和拉曼光谱检测。考虑到过滤速度，应选择亲水性好、水通量大且不易堵塞的混合纤维素膜或不锈钢滤膜。但不锈钢滤膜不透光且对光的反射不固定，只适用于红外ATR成像和拉曼的检测，因此使用混合纤维素滤膜的效果最佳。此外，滤膜孔径越小可保留的微塑料粒径越小，滤膜上的残留物质也越多，过滤速度越慢，因此需根据具体情况选择合适的孔径。因本研究显微红外和显微拉曼可检出的微塑料粒径在3μm以上，故选用3μm的混合纤维素膜。

2.3 光谱检测与回收率

微塑料常用的检测方法有热裂解气相色谱－质谱、染色法、光谱法等。其中，热裂解气相色谱－质谱能对微塑料进行定性定量检测，但单次检测量过小，更适用于纳米微塑料；染色法能辅助检测，但容易高估生物体内的微塑料存在且无法定性分析，同时将生物体内的微塑料和其他组织分开染色仍是一个考验。因此光谱法仍是最适于海洋生物中微塑料的检测方法。光谱法可分为普通模式和成像模式两种，其中成像模式下，显微红外成像适用于粒径10μm以上的微塑料颗粒检测［30］，并且若配置焦平面阵列可增加单次检测面积，减少检测时间；显微拉曼则适用于粒径1μm以上微塑料颗粒的检测，且能检出的微塑料数量高于显微红外［30］。但成像模式过于耗时且需搭配相应的成像模块，因此本研究在普通模式下进行探索。

显微红外是微塑料分析的常用光谱检测方法之一，一般可分为透射、反射和ATR 3种测试模式。微塑料的定性检测过程中，使用金属滤膜、氧化铝滤膜可进行反射、透射和成像模式的检测，使用滤膜添加金属镀层也可在反射模式下检测。而普通滤膜无法使光反射或透射，需采用ATR模式进行测试。ATR模式可分为显微ATR和普通ATR模式两种。在显微ATR模式下进行微塑料检测时，若微塑料表面平整，可与显微ATR晶体紧密接触，即可采集到样品的红外谱图。当滤膜凹凸不平或微塑料呈翘曲悬空状态时，单点显微ATR晶体很难与微塑料紧密接触，导致无法采集信号，且单点ATR晶体所产生的压力会破坏较易碎的微塑料。压样面积较大的ATR组件可使晶体与微塑料充分接触，有效避免上述现象对检测的影响，如PerkinElmer Spotlight 400的ATR组件。由于研究中ATR配件采样面积小，其表面晶体较难与微塑料紧密接触，无法采集到较好的红外光谱图，因此本研究借助显微镜，用镊子取出颗粒，使用普通ATR进行检测。研究发现采用在样品台侧面补光的方式，可方便发现膜上的小颗粒。通过普通ATR检出了所研究的6种微塑料（图2），其粒径分布为75～300μm。受微塑料寻找和颗粒转移的限制，目前检测粒径下限为75μm。

图2 普通ATR模式下检出的微塑料Fig．2 Microplastics detected under ordinary ATRA．HDPE；B．PVC；C．PS；D．PP；E．PET；F．PA

显微拉曼也是常用的微塑料光谱检测方法之一。将待测滤膜置于样品台上，调节样品台位置聚焦并利用显微镜寻找微塑料颗粒，在普通单点扫描模式下采集待测样品的拉曼光谱，检出的6种微塑料及其拉曼光谱见图3，其粒径分布为15～300μm。实验发现，用拉曼检测膜上的微塑料，当测定小于15μm的颗粒时，因滤膜上残留生物组织产生的荧光背景干扰或小颗粒拉曼散射太弱，将导致待测微塑料样品无法检出。因此，使用显微拉曼单点检测的粒径下限为15μm。

图3 显微拉曼单点检测模式下检出的微塑料Fig．3 Microplastics detected in single-point detection mode of Raman microscopy A．HDPE；B．PS；C．PA；D．PP；E．PET；F．PVC

由于过滤时微塑料易附着在过滤器底部边缘，造成微塑料颗粒的丢失，影响回收率。结果表明，添加的颗粒粒径小于500μm时，回收率为70%；添加的颗粒粒径大于500μm时，回收率可达100%；混合添加50～1 000μm的微塑料时回收率达83．3%。通过人工操作将微塑料从器壁转移到膜上，回收率可达90%以上。

2.4 典型样品检测

通过拉曼光谱对疑似微塑料的颗粒进行分析，青蛤、文蛤中平均有3．2个纤维状物质检出，白蛤、花甲和青口贝中平均有2．5个透明物质检出，但均不是微塑料，可能是购买的贻贝所处环境微塑料污染轻微导致其未摄入微塑料颗粒。

3 结 论

本研究通过实验发现，对于海洋生物中微米级微塑料的检测，采用氢氧化钾在40℃下消解36 h最佳。在微塑料粒径大且样品量少的情况下，可使用显微红外ATR、成像模式和显微拉曼单点检测模式进行检测（可满足75μm以上颗粒的检测）；而微塑料粒径小但样品量少的情况下，用显微拉曼单点检测模式进行测试的效果较好（可满足15μm以上颗粒的检测）。根据文献［30－33］，对粒径更小或样品量大的情况，建议使用配有较好成像配件的显微红外或显微拉曼仪器在成像模式下进行检测。