高效液相色谱法同时测定生活用纸及纸制品中19种有机抗菌剂

綦 艳，李锦清，陈满英，伍尚森，唐楚林，刘德群

（广东产品质量监督检验研究院，广东 顺德 528300）

生活用纸及纸制品在生产加工和贮藏过程中常会使用有机抗菌剂，以抑制和杀灭细菌、霉菌、藻类等，达到防腐、抑菌效果，增加纸制品的贮藏和使用寿命［1］。常用的有机抗菌剂有对羟基苯甲酸酯类、季铵盐类（如苯扎氯铵等）、异噻唑啉酮类等，由于缺乏完善的检测标准，某些有机抗菌剂并未列入监管项目，可能会导致生活用纸质量存在安全隐患。有机抗菌剂在短期内对环境和人体的危害不明显，但长期积蓄达到一定含量后，对人体和环境产生的危害不能忽视。氯苯酚类物质常用作木材防腐剂，起到抗菌防腐作用，也是制浆造纸行业中氯化消毒和漂白过程中的主要副产物之一。这些物质若残留于纸中或作为废液排放至环境中，被人体吸收后对肝、肾、肺会有损伤，特别是经生物和环境的富集和累积效应，毒性大大增强，被列为疑似致癌物质［2］，许多国家对氯苯酚类物质的使用有严格限制。因此，建立生活用纸及纸制品中对羟基苯甲酸酯类、季铵盐类、氯苯酚类等有机抗菌剂的检测方法具有十分重要的意义。

目前有机抗菌剂的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［3－5］、气相色谱法（GC）［6］、高效液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS/MS）［7－11］、气相色谱－质谱联用法（GC－MS）［12－14］以及超高效液相色谱－静电场轨道阱高分辨质谱法［15］。其中HPLC－MS/MS法和GC－MS法灵敏度高，适用于低含量有机抗菌剂检测，但仪器昂贵，维护成本高，在生产企业中难推广；GC法测定氯苯酚类抗菌剂通常需要繁琐的衍生步骤。HPLC法无需衍生即可同时检测多种有机抗菌剂，普适性强，维护成本低，具有在企业中推广应用的潜力，可为企业的纸制品质量控制提供可靠的技术支撑。

关于纸制品中有机抗菌剂检测的文献报道主要集中在食品接触类纸制品方面［16－18］，而生活用纸及纸制品的报道较少。生活用纸及纸制品中可能添加的有机抗菌剂种类较多，若对每一类抗菌剂进行检测，则存在效率低、成本高等不足。针对氯苯酚类、季铵盐类、对羟基苯甲酸酯类等多种有机抗菌剂同时检测的方法尚未见文献报道。本文采用高效液相色谱建立了生活用纸及纸制品中19种有机抗菌剂（包括7种氯苯酚类、6种季铵盐类和6种对羟基苯甲酸酯类化合物）的分析方法，并将其用于实际样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪，配Waters 2998光电二极管阵列（PDAD）检测器（美国Waters公司）；SIGMA 3-18K高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；IKA涡旋混合器（德国IKA公司）；EYELA旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）；DT-502A电子天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司）；JP-C300超声波清洗机（广州吉普超声波电子设备有限公司）。

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；磷酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；四丁基硫酸氢铵（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

7种氯苯酚类化合物标准品：对氯间二甲苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4，6-三氯苯酚、2，3，4，5-四氯苯酚、2，3，4，6-四氯苯酚、2，3，5，6-四氯苯酚、五氯苯酚（纯度均不低于97%，Dr．Ehrenstorfer公司）。6种季铵盐类化合物标准品：苯扎氯铵、西吡氯铵、劳拉氯铵、苄索氯铵、地喹氯铵、西他氯铵（纯度均不低于97%，北京曼哈格生物科技有限公司）。6种对羟基苯甲酸酯类化合物标准品：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯（纯度均不低于99%，Dr．Ehrenstorfer公司）。

1.2 标准溶液的制备

准确称取上述标准品10 mg（精确至0．01 mg）分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀后配得质量浓度为1 000μg/mL的标准品储备液，于－20℃保存。分别精密移取适量上述标准品储备液，用甲醇－水溶液（1∶1，体积比）稀释成系列混合标准工作溶液，使氯苯酚类、季铵盐类和对羟基苯甲酸酯类化合物的质量浓度分别在0．05～20 mg/L、0．1～20 mg/L、0．02～50 mg/L之间。

1.3 样品前处理

取代表性样品，剪碎至5 mm×5 mm以下，混匀，称取2．0 g（精确至0．01 g）试样置于50 mL离心管中，加入20 mL 0．5%甲酸－甲醇溶液，室温超声提取20 min，9 000 r/min离心3 min，用布氏漏斗抽滤，滤液转移至鸡心瓶中。从布氏漏斗中取出残渣，再用20 mL 0．5%甲酸－甲醇溶液超声提取10 min，9 000 r/min离心3 min后，用布氏漏斗抽滤，滤液合并于同一鸡心瓶中，45℃水浴条件下旋转蒸发浓缩至约1 mL，氮气吹干，用2．0 mL甲醇－水溶液（1∶1，体积比）溶解，过0．22μm有机系滤膜，待测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate AQ C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；柱温：25℃；流动相：A为乙腈，B为甲醇，C为0．05%磷酸水溶液（含0．475 3 g四丁基硫酸氢铵），梯度洗脱程序见表1；进样体积：50μL；检测波长：PDAD检测器，波长范围为191～400 nm。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将19种有机抗菌剂的标准品储备液分别用甲醇－水溶液（1∶1）稀释100倍后，在191～400 nm范围内进行紫外光谱扫描。结果显示，氯苯酚类化合物在210 nm和230 nm处均有较强吸收；季铵盐类化合物仅在210 nm有较强吸收，其他波长的吸收很弱；对羟基苯甲酸酯类化合物在210 nm和256 nm处均有较强的特征吸收峰。由于210 nm波长易受杂质干扰，通常应避免作为检测波长，但本实验中季铵盐类化合物在C18色谱柱上的保留能力较强，出峰时间较迟，保留时间均在45 min后，与杂质分离充分，不易受到杂质峰干扰。因此，综合考虑19种有机抗菌剂的响应值和干扰情况，氯苯酚类、季铵盐类和对羟基苯甲酸酯类化合物分别以230、210、256 nm为检测波长。采用PDAD检测器在191～400 nm范围进行监测，提取特定波长进行定量，其他特征吸收光谱图辅助定性。

2.2 流动相的选择

氯苯酚类、季铵盐类和对羟基苯甲酸酯类化合物的性质差异较大，其中氯苯酚类化合物包含三氯苯酚同分异构体（2，4，5-三氯苯酚与2，4，6-三氯苯酚）和四氯苯酚同分异构体（2，3，4，5-四氯苯酚、2，3，4，6-四氯苯酚与2，3，5，6-四氯苯酚），这些同分异构体的物理化学性质差别不大，色谱行为相似，因此建立一种完全分离19种有机抗菌剂的液相色谱法难度较大。本研究采用流动相中添加离子对试剂，磷酸调节pH值，再结合梯度改变流动相比例和流速的方式，使19种有机抗菌剂的色谱峰完全分离。

氯苯酚类和对羟基苯甲酸酯类化合物均为弱酸性化合物，较易电离，在流动相中添加少量酸可抑制电离，使其形成中性分子，改善其在C18色谱柱上的分离度和色谱峰形。季铵盐类为弱碱性化合物，前期实验发现酸性流动相条件下该类化合物在C18色谱柱上也具有较好的分离度和色谱峰形。考察了乙腈、甲醇分别与0．05%甲酸水溶液、0．05%乙酸水溶液和0．05%磷酸水溶液组合作为流动相体系对19种有机抗菌剂的分离效果。结果表明，上述流动相组合均不能使19种有机抗菌剂的色谱峰完全分离，部分季铵盐类和氯苯酚类化合物的色谱峰重叠，但以乙腈－0．05%磷酸水溶液为流动相时，达到基线分离的色谱峰最多，峰形最好。在流动相中添加适量四丁基硫酸氢铵，可提高结构特殊、不易分离化合物的分离效果；由于甲醇的粘度比乙腈大，且两者极性存在差异，适量加入甲醇可调整流动相的极性，提高分离度。因此，实验以乙腈和0．05%磷酸水溶液流动相为基础，在乙腈中加入甲醇，在0．05%磷酸水溶液中加入四丁基硫酸氢铵离子对试剂，以进一步提高色谱分离度。通过比较甲醇、四丁基硫酸氢铵、磷酸的加入量，并结合流速的变化，确定优化的流动相及梯度洗脱程序如“1．4”所示。

2.3 色谱柱的选择

分别考察了Phenomenex Luna C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4．6 mm，5μm）和Welch Ultimate AQ C18（250 mm×4．6 mm，5μm）5种色谱柱对19种有机抗菌剂的分离效果。结果表明，耐100%水相的Welch Ultimate AQ C18色谱柱在优化色谱条件下能使19种有机抗菌剂的色谱峰完全分离，其他4种C18色谱柱均存在部分色谱峰重叠，分离效果较差。因此，选择Welch Ultimate AQ C18（250 mm×4．6 mm，5μm）作为分离色谱柱。优化条件下，19种有机抗菌剂标准溶液（5 mg/L）在210 nm检测波长下的色谱图见图1。

图1 19种有机抗菌剂标准溶液的色谱图（5 mg/L）Fig．1 Chromatogram of 19 organic antibacterial agents standard solution（5 mg/L）the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.4 提取溶剂的选择

根据待测化合物性质，比较了甲醇作为提取溶剂时不加酸和加入少量甲酸的提取效果。结果显示，加入少量甲酸的提取溶剂能使氯苯酚类化合物的回收率提高约10%，对其他物质无影响，因此在提取溶剂中加入少量甲酸。氯苯酚类和对羟基苯甲酸酯类化合物的分子结构均含有羟基，具有一定极性，与季铵盐类化合物均易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂。本研究分别以甲酸酸化的甲醇、乙腈、丙酮作为提取溶剂，在相同实验条件下对自制的添加19种有机抗菌剂标准品的样品进行检测，比较提取效果。结果表明，甲酸酸化的丙酮作为提取试剂时，提取液杂质最多，干扰目标物的测定；甲酸酸化的乙腈对氯苯酚类化合物的提取效果较差，回收率低；甲酸酸化的甲醇作为提取溶剂时，杂质较少，因此选择甲酸酸化的甲醇作为提取溶剂。进一步比较了甲酸添加量对提取效果的影响，发现甲酸的最佳添加量为0．5%，此时19种有机抗菌剂的提取回收率均达到70%以上，继续增加甲酸比例，回收率变化不明显。因此，本研究以0．5%甲酸－甲醇溶液作为提取溶剂。

2.5 提取次数的优化

采用0．5%甲酸－甲醇溶液作为提取溶剂，以湿纸巾、纸巾、纸杯作为基质对提取次数进行了优化。由于纸制品对提取溶剂的吸附作用很强，即使离心后也不能使样品与提取溶剂完全分离，本研究采用布氏漏斗抽滤以充分回收被纸制品吸附的提取溶剂，提高目标物的回收率。实验结果显示，采用布氏漏斗抽滤，样品提取2次即可达到充分提取，上述3种基质中19种有机抗菌剂的回收率均大于70%，因此选择提取2次。

2.6 线性关系与检出限

在优化的条件下，对19种有机抗菌剂的混合标准工作溶液进行测定，以目标化合物的峰面积为纵坐标（y），对应质量浓度为横坐标（x，mg/L）作线性回归方程。结果显示，氯苯酚类、季铵盐类和对羟基苯甲酸酯类化合物分别在0．05～20 mg/L、0．1～20 mg/L、0．02～50 mg/L质量浓度范围内呈良好线性关系，相关系数r≥0．996 0；按信噪比（S/N）不低于3时计算检出限（LOD），五氯苯酚的检出限为0．1 mg/kg，其他6种氯苯酚类化合物的检出限均为0．2 mg/kg；季铵盐类化合物的检出限均为0．3 mg/kg；对羟基苯甲酸酯类化合物的检出限均为0．05 mg/kg（见表2）。

表2 19种有机抗菌剂的线性范围、回归方程、相关系数（r）及检出限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r）and limits of detection（LOD）of 19 organic antibacterial agents

2.7 回收率与相对标准偏差

在优化实验条件下，选择经测定不含待测物质的湿纸巾、纸巾、纸杯为代表样品，分别进行3个浓度水平的加标回收实验，其中对羟基苯甲酸酯类化合物的加标水平为0．2、0．4、2．0 mg/kg；氯苯酚类和季铵盐类化合物的加标水平为1．0、2．0、10．0 mg/kg；每个浓度水平平行测定6次，平均回收率及相对标准偏差（RSD）见表3。结果显示，19种有机抗菌剂的平均回收率为74．8%～101%，RSD为2．2%～5．6%，具有较好的准确度和精密度，满足生活用纸及纸制品中19种有机抗菌剂的分析要求。

表3 19种有机抗菌剂的平均回收率及相对标准偏差（n=6）Table 3 Mean recoveries and relative standard deviations（RSD）of 19 organic antibacterial agents（n=6）

（续表3）

2.8 实际样品检测

从市场上购买湿纸巾、纸巾、纸杯各10批次，采用本方法进行测定。结果显示，纸巾和纸杯中均未检出19种有机抗菌剂；湿纸巾中未检出氯苯酚类化合物，但有2批次湿纸巾检出对羟基苯甲酸甲酯，含量分别为11．3、15．4 mg/kg；1批次湿纸巾检出苄索氯铵，含量为132．3 mg/kg；1批次湿纸巾同时检出苄索氯铵和西吡氯铵，含量分别为152．2、246．5 mg/kg。图2为代表性湿纸巾阳性样品的色谱图。

图2 湿纸巾阳性样品的色谱图Fig．2 Chromatograms of positive wet tissue samplesA：wet tissue containing benzethonium chloride and cetylpyridinium chloride；B：wet tissue containing methyl 4-hydroxybenzoate

3 结 论

本文通过对色谱分析条件和样品前处理条件进行优化，建立了同时测定生活用纸及纸制品中19种有机抗菌剂（包括7种氯苯酚类化合物、6种季铵盐类化合物和6种对羟基苯甲酸酯类化合物）含量的高效液相色谱法，方法检出限为0．05～0．3 mg/kg；样品加标回收率为74．8%～101%，RSD为2．2%～5．6%。该方法简单、快速、准确可靠，适用于生活用纸及纸制品中19种有机抗菌剂的同时检测。