肺栓塞患者差异甲基化位点及区域分析*

曹国磊， 何丽丽， 马荣辉， 唐 乐， 曹嘉瑞， 牛海文， 罗 琴

新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸与神经内科，乌鲁木齐 830011

肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism，PTE)是呼吸系统疾病中比较常见的一种血管疾病，是由于各种原因导致的血栓栓子堵塞肺动脉干或其分支，引起肺循环障碍的临床、病理生理综合征[1-2]。研究显示，近年来国内PTE的患病率、疾病构成比均显著增长[3]。高达15%的PTE患者在患病后1月内死亡，30%的患者在未来10年内复发[4]。

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的催化作用下，二核苷酸中C核苷酸上第5个碳原子发生甲基化转变，成为甲基化的胞嘧啶[5]。研究证明，DNA的异常甲基化在恶性肿瘤、自身免疫性疾病及心血管疾病中发挥着重要作用[6]，但关于其与PTE关系的研究却罕见报道。本研究拟通过Illumina Infinium Methylation EPIC Bead Chip芯片(850K芯片)甲基化检测平台在全基因组水平检测PTE患者与正常对照者每个CpG位点的甲基化水平，并对比分析PTE患者与正常对照组之间差异甲基化位点、区域及其目的基因，进一步揭示PTE的发病机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：经肺动脉CT血管造影确诊肺动脉存在血栓，无心脑血管疾病史，无内分泌疾病史。对照组选取标准：选取与PTE组性别比例、年龄相当，既往无心脑血管、血液、内分泌、肝肾疾病，且无慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等病史的相同地区人群作为正常对照组。所有入组人员均签署相关知情同意书，并经新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准(伦理审批号为：2019BC007)。收取2019年1月至2019年12月就诊的肺栓塞患者和正常对照人群外周血标本各10例，进行DNA提取。

1.2 甲基化检测

采用Illumina Infinium Methylation EPIC Bead Chip芯片(850K芯片)甲基化检测平台检测分析各样本中每个CpG位点的甲基化水平并行差异位点、区域分析。

1.2.1 DNA的提取及样品质检 使用试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)提取外周血中的基因组DNA，用分光光度计定量，并将样品调到标准浓度50 ng/μL，共计20 μL，然后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳。样品电泳主带清晰，通常不小于10 kb，没有明显降解，总量5 μg以上，可进行下游的甲基化芯片实验。

1.2.2 亚硫酸盐转化及DNA扩增 根据Illumina官方推荐的Zymo EZ DNA Methylation Kit优化方法进行亚硫酸盐转化。

1.2.3 制备MSA3板 在样本中加入0.1 mol/L NaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂，在37℃恒温条件下过夜孵育。

1.2.4 DNA的片段化、沉淀、重悬 扩增后产物经过酶解处理，得到片段化DNA。DNA片段加入异丙醇在4℃下离心沉淀。沉淀后的DNA在空气中干燥后，加入杂交缓冲试剂使DNA沉淀重新溶解。

1.2.5 DNA芯片制备 将重悬后的DNA样本与准备好的芯片杂交，置于杂交炉内过夜。在杂交过程中，片段化后的DNA经过变性，与特异位点的50个碱基(连接在芯片的微珠上)退火。洗去未杂交和非特异杂交的DNA，以捕获到的DNA为模板，在芯片上进行单碱基的延伸反应，在芯片上加上可检测的荧光基团，从而区分样本的甲基化状况。将反应完成的芯片放入XC4试剂中，使其表面包裹上一层粘性透明液体，再将其放入真空环境下干燥1 h，从而将芯片包被，以使其信号稳定较长的时间。

1.2.6 芯片扫描和数据提取 提前下载相应的manifest文件，将处理好的芯片放入扫描仪，利用激光激发芯片上单碱基延伸产物的荧光基团，扫描仪获取由荧光基团发出的荧光，并生成原始数据，记录扫描结果存放的位置。由此所得的数据直接导入R包Champ软件进行分析，从而得到每个样本每个位点的甲基化水平数据。

1.2.7 差异甲基化位点分析 将芯片原始扫描数据idat文件直接导入R包Champ进行分析，得到每个样品每个CpG位点的原始信号值、样品分组等信息。然后使用一系列R软件包计算出每个样品每个CpG位点的甲基化水平，进行甲基化差异分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.8 差异甲基化区域分析 采用Bumphunter的方法寻找差异甲基化区域(differentially methylated regions，DMR)，该方法首先根据位点距离信息来聚簇(cluster)，然后再在每个cluster中筛选出甲基化水平一致的连续候选区段，并根据候选区段构建线性统计模型，筛选出明显差异的区段(P<0.05)。

1.3 统计学分析

采用R包Limma 3.32.10进行差异甲基化分析，然后根据P值筛选差异位点(P<0.05)。采用Limma moderatedt-statistics和empirical Bayes方法检验差异位点的显著性。采用Bumphunter的方法根据候选区段构建线性统计模型，筛选出明显差异的区段(P<0.05)。

2 结果

2.1 差异甲基化位点分析

将PTE与正常对照组所有甲基化位点进行对比分析，在全基因组水平共筛选到95286个有意义的差异CpG位点(P<0.05)，其中37983个为高甲基化，57303个为低甲基化(图1)。对应28273个目的基因，其中13785个为高甲基化，14488个为低甲基化。我们分别列出两组差异最大的高甲基化与低甲基化CpG位点各10个(表1)，显著差异CpG位点在CpG岛的分布情况为：CpG岛29%(27483)、Shore 18%(16700)、Shelf 6%(6011)、Open sea 47%(45092)。

图中标注为红色的是高甲基化位点，标注为蓝色的是低甲基化位点，标注为灰色的是无显著差异位点。图1 差异CpG位点分布火山图Fig.1 Volcano map of the distribution of differential CpG sites

表1 PTE组与正常对照组差异甲基化位点对比Table 1 Comparison of differential methylation sites between the PTE group and the normal control group

2.2 差异甲基化区域分析

采用Bumphunter的方法寻找PTE与正常对照组差异甲基化区域，结果筛选出两组差异甲基化区域DMR-1、DMR-2，分别位于3号染色体(195489708-195490309)和6号染色体(49681178-49681774)上(均P<0.05)。DMR-1宽度601 bp，DMR-2宽度596 bp，DMR-1包含8个CpG位点，其所属的簇包含8个CpG位点，DMR-2包含11个CpG位点，其所属的簇包含11个CpG位点，且PTE组DMR-1与DMR-2所有CpG位点甲基化水平均较正常对照组高(表2)。DMR-1所含CpG位点为cg23170091、cg18918831、cg16034541等，目的基因为MUC4；DMR-2所含CpG位点为cg01706515、cg14997592、cg26715042等，目的基因为CRISP2(表3)。

表2 PTE组与正常对照组差异甲基化区域对比Table 2 Comparison of differentially methylated areas between the PTE group and the normal control group

表3 PTE组与正常对照组差异甲基化区域所含甲基化位点及目的基因Table 3 Methylation sites and target genes contained in the differentially methylated regions of the PTE group and the normal control group

3 讨论

已有许多研究证据表明DNA异常甲基化在慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、肺癌、特发性肺纤维化等肺部疾病中的重要作用。如Sundar等[7]研究发现，吸烟者和慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中BID和NOS1AP基因的表达与DNA甲基化状态的改变关系显著，继而影响细胞的衰老、凋亡等。而Yokoyama等[8]研究证明，TET1所介导的DNA低甲基化可调控肺腺癌MUC4基因的表达，但关于PTE与DNA甲基化的关系目前尚未见报道。

本研究利用甲基化检测平台在全基因组水平检测PTE组患者及正常对照组人群CpG位点甲基化水平，对比分析PTE组与正常对照组差异甲基化位点及区域。结果在全基因组水平共筛选到95286个有意义的差异CpG位点(P<0.05)，其中高甲基化的位点cg11738485，cg06417478，cg04657146等差异较大，低甲基化的位点cg06758191、cg18105134、cg21790413等差异较大，对应目的基因分别为HOOK2(cg06417478)、PROZ(cg18105134)。HOOK2(微管系连蛋白2)是一种蛋白质编码基因，有研究表明2型糖尿病和肥胖患者HOOK2基因的甲基化与2型糖尿病的发生相关[9]，其在血栓性疾病中的作用目前未见报道。而PROZ(蛋白质Z)是一种维生素K依赖的蛋白质，具有促凝与抗凝双向调节作用，Santacroce等[10]对197例深部静脉血栓(DVT)和197例健康人群的研究表明低PROZ血浆水平与DVT相关。这种关系是否建立在PROZ基因甲基化的基础之上有待我们进一步研究证实。

众所周知，基因的转录过程有赖于CpG岛的甲基化状态，若是甲基化状态出现了异常，便会影响到基因的转录过程。然而，DNA异常甲基化不仅发生在CpG岛，也可能发生在CpG Shore、CpG Shelf等区域。本研究发现，显著差异的CpG位点在CpG岛的分布情况为：CpG岛29%(27483)、CpG Shore18%(16700)、CpG Shelf 6%(6011)、Open sea 47%(45092)。除广阔的Open sea区域之外，发生在CpG岛的差异CpG位点依然是最多的，达到了29%，远高于CpG Shore和CpG Shelf。这与Dudziec等[11]有关CpG岛和CpG shores的研究结果相一致。

差异甲基化区域(DMR)指基因组上不同组间甲基化值有明显差异的一个片段。本研究筛选出2组差异甲基化区域DMR-1，DMR-2，发现PTE组DMR-1与DMR-2所有CpG位点甲基化水平均较正常对照组高。DMR-1所对应目的基因为MUC4，DMR-2所对应目的基因为CRISP2。关于MUC4基因，研究主要集中在与肿瘤发生、发展的关系，并可作为肿瘤发展过程的标记物。在表观遗传学方面，曾有学者报道MUC4的表观遗传学有赖于5′-末端的2个CpG岛，在某些肿瘤中这种调节显得尤为重要[12]。而肿瘤患者因其体内血液高凝状态等本身便是血栓高危因素，有研究显示，肺癌患者发生静脉血栓的风险是普通人群的22倍，并使患者病死率增加2～8倍[13]。据此，我们推测，或许是由于MUC4基因的异常甲基化导致了恶性肿瘤的发生，继而引起了血栓的形成；抑或是MUC4基因的异常甲基化本身便与肺栓塞有着直接的关系。无论是哪种可能，DMR-1中的这些差异CpG位点都值得我们去关注并继续研究。关于CRISP2基因，目前研究主要集中在其与弱精症之间的关系，但本研究却发现了CRISP2基因的高甲基化与肺栓塞的关系，为广大学者提供了新的思路。

综上所述，肺栓塞患者CpG位点的高甲基化可能参与了肺栓塞的发生，差异较大的CpG位点cg06417478、cg18105134及其目的基因HOOK2、PROZ和DMR-1、DMR-2中包含的差异CpG位点及其目的基因MUC4、CRISP2的异常甲基化或许在肺栓塞的发生中起到重要的作用。课题组拟进一步扩大样本量，同时对以上基因相关mRNA、蛋白等进行验证，以期深入揭示表观遗传学机制在肺栓塞发生、发展中的作用，为肺栓塞的研究提供新的思路。