饲料中三种聚醚类药物残留检测的改进方法

杜 杨，杜 磊，孟 佳

（1.安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南 安阳 455000；2.安阳工学院 生物与食品工程学院，河南 安阳 455000）

聚醚类抗生素（Polyether antibiotics，PEs）是20世纪70年代左右开始投放市场的、具有离子载体性质的一类抗生素。比较常见的聚醚类药物包括盐霉素（Salinomycin，SAL）、莫能菌素（Monensin，MON）、拉沙菌素（Lasalocid，LAS）、那拉菌素（Narasin，NAR）、山度霉素（Semduramicin，SEM）、马杜霉素（Maduramicin，MAD）等。这类抗生素普遍具有促进离子穿过细胞膜的能力，对鸡常见的球虫病具有较好的防治效果。此外，其在鸡的饲料报酬及增重方面的效果优于传统抗球虫药氨丙啉和氯羟吡啶，因此被广泛用于养鸡业[1]。但由于其具有较强的细胞毒性，添加过量会造成药物残留，因此用药的安全范围非常窄[2]。肉制品的药物残留能够通过食物链严重影响人类健康[1]。因此，聚醚类药物残留量的检测技术研究，对保障畜禽产品质量安全有着十分重要的意义。原农业部《关于发布<药物饲料添加剂品种目录及使用规范>的公告》中规定了甲基盐霉素、盐霉素及莫能菌素可以作为药物饲料添加剂使用，同时也规定了其使用方法和添加量。

聚醚类抗生素的残留分析方法主要包括微生物检测法、分光光度法、色谱法（薄层层析法、高效液相色谱、液相色谱—串联质谱法）及免疫学方法[3]。本文参照《原农业部1862号公告-4-2012 饲料中5种聚醚类药物的测定 液相色谱—串联质谱法》[4]，给出了一种更为合理省时的改进方法，在保证检验结果准确可靠的前提下，把前处理操作过程化繁为简，既缩短了前处理的时间，又减小了前处理过程中可能产生的系统误差，给饲料中盐霉素、甲基盐霉素及莫能菌素3种聚醚类药物残留的检测检验工作效率带来了极大提升。

1 材料与方法

1.1 耗材与试剂

试验中所用水为GB/T 6682中规定的一级水，所用试剂均为分析纯，乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯；正己烷；乙醚；二氯甲烷；乙醚一正己烷（50∶50）：乙醚、正己烷按体积比1∶1混匀；二氯甲烷一甲醇（90∶10）：二氯甲烷、甲醇按体积比9 ∶1 混匀；甲基盐霉素（Narasin，NAR）≥97%，盐霉素（Salinomycin，SAL）≥98%，莫能菌素(Monensin，MON)≥90%；硅胶固相萃取柱，500 mg/3 ml。

1.2 仪器及设备

液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾电离源；组织匀浆机；涡动仪；氮吹仪；离心机；天平：感量0.01 g；分析天平：感量0.000 01 g；振荡器；固相萃取装置；0.2 μm有机滤膜；移液器：100 μl、1 000 μl。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱 色谱柱：C18（1.7 μm，2.1*100 mm），或其他效果等同的C18柱；进样量：10.0 μl；流速：0.3 ml/min；柱温：25±5℃；流动相：0.1%甲酸/甲醇溶液。洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.2 质谱 离子源：ESI；扫描方式：ES+；电离电压：3.9 kV；源温度：150℃；雾化温度：500℃；锥孔气流速：150 L/h；雾化气流速：7.00 bar；溶剂气流速：1 000 L/h；碰撞气流速：0.17 ml/min。

1.4 检测方法

1.4.1 储备液及工作液配制 步骤1：分别称取3种标准品约10 mg于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到1 000 μg/ml3种标准溶液（-20℃，12个月）。步骤2：分别取步骤1标准溶液各1 ml于100 ml容量瓶中，甲醇定容，得到10 μg/ml混合标准液（-20℃，6个月）。步骤3：分别取步骤2混合标准液各1 ml于200 ml容量瓶中，用乙腈（0.1%甲酸）定容，得到50 ng/ml标准中间液。步骤4：分别取步骤3标准中间液各1 ml于10 ml量瓶中，用乙腈（0.1%甲酸）定容，得到5 ng/ml标准工作液。

1.4.2 阳性对照制备 取1 000 ng/ml中间液（把步骤2配置溶液稀释10倍得到1 000 ng/ml中间液）100 μl加入空白样品中，即得添加浓度为50 ng/g的阳性对照。

1.4.3 提取 称取试样2 g（±0.01 g）于50 ml离心管中，加20 ml乙腈，涡旋震荡提取约30 min，离心5 min，转速6 000 r/min，准确移取上清液2 ml于10 ml尖底离心管中，60℃氮吹，加入3 ml正己烷溶解残渣（转速由低到高，小心调节不要造成溶液飞溅，2 000 r/min左右），备用。

1.4.4 净化 取硅胶固相萃取柱，加3 ml正己烷预洗，备用液过柱，加乙醚—正己烷10 ml于备用液的离心管中，洗涤，挤干，加二氯甲烷—甲醇5 ml于备用液的离心管中，在固相萃取装置中放入洗脱架、离心管，洗脱并收集洗脱液，挤干，60℃氮气吹干，用乙腈（含0.1%甲酸）2.0 ml复溶（转速由低到高，小心调节不要造成溶液飞溅，2 000 r/min左右）过0.2 μm滤膜后，供液相色谱一串联质谱仪检测。

1.4.5 定量方法 采用基质单点校正法，试样中聚醚类药物的含量为X，以质量分数微克每千克（μg/kg）表示，残留量计算公式如下所示。

式中，A为供试试料溶液中聚醚类药物峰面积，AS为标准品溶液中聚醚类药物峰面积，CS为标准溶液浓度（ng/ml），V为定容体积（ml），m为称样量（g），n为稀释倍数。

2 结果与分析

本试验在国标方法的基础上专门针对饲料中的盐霉素、甲基盐霉素及莫能菌素给出了具体的前处理方法。在提取过程中，国标方法用到乙腈20 ml两次提取转移，合并两次提取液后用旋蒸仪蒸干，5 ml正己烷复溶后再离心。相对于国标方法本试验方法提取液仅用乙腈20 ml提取一次，并取上清液2 ml经氮吹仪吹干，复溶液3 ml，过程操作简易、清晰、快速、提取充分，能够降低损失、减少有毒试剂的使用。国标方法的净化过程使用8 ml乙醚—正己烷洗涤，6 ml二氯甲烷—甲醇洗脱。而本方法中净化过程使用10 ml洗涤液、5 ml洗脱液，洗涤更加充分，过程损失更小，回收率达到95%～105%，重复性条件下两个平行测定的结果相对偏差为5%（国标中规定≤15%），不同实验室间检测结果相对标准偏差为5.4%，3种聚醚类药物的定量限均为10.0 μg/kg。

由此可见，本试验改进方法相对国标方法更加准确、高效，极大地提高了工作效率；节省了耗材，减少了对人体有害试剂的使用；在减少前处理设备使用频率的同时，也减小了试验中产生的系统误差，对饲料中聚醚类药物残留检测工作具有重要作用。