养心颗粒改善心力衰竭大鼠模型水钠潴留的作用机制研究

马 妍，张军茹，任得志

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是临床常见病、多发病，具有患病率、致残率及死亡率高的特点，是严重危害人类健康的主要疾病之一[1-3]。水钠潴留是心力衰竭的标志，亦是加重心力衰竭的关键因素，因此，消除水钠潴留是缓解心力衰竭的重要手段[4]。中医学并无心力衰竭之名，更无“水钠潴留”一说，根据其证候、病因、病机，多归于中医学“心水”“水肿”“痰饮”等范畴。名老中医王朝宏教授于20世纪80年代末创制了养心合剂，基于此方制备的养心颗粒，临床广泛用于心力衰竭的治疗。本课题组前期临床研究已经证实，养心颗粒在缓解水钠潴留、保护心功能方面显示出独特优势，可能与调控血管加压素(AVP)-水通道蛋白-2(AQP2)通路有关[5-9]，但具体机制仍不清楚。本研究旨在探究养心颗粒改善心力衰竭水钠潴留的作用机制，为临床中医药治疗心力衰竭水钠潴留提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠70只，体质量(180±20)g。西安交通大学医学院实验中心提供。

1.2 药物及制备 养心颗粒，由陕西省中医医院中药研究所提供；盐酸阿霉素粉针(浙江海正药业股份有限公司生产，批号：091001)；托伐普坦(浙江大冢制药有限公司，国药准字：H20110115)。

1.3 主要试剂与仪器 普通光学显微镜(型号Motic BISERES，日本Olympus公司)；酶标仪(型号Multiskan Mk3， 芬兰雷勃集团生产)；数码医学图像分析系统(Motic Med 6.0，厦门麦克奥迪公司生产)；全自动生化分析仪(型号7170，日本日立公司生产)；大鼠N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)试剂盒(上海微蒙物科技有限公司生产)，AVP、AVPV2受体(AVPV2R)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(江苏卡尔文生物技术有限公司生产)；环磷酸腺苷(cAMP)、 环磷酸腺苷交换蛋白(Epac)、AQP2 ELISA试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司生产)；cAMP、Epac、AQP2抗体(Abcam公司生产)；哺乳动物组织总蛋白提取试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 实验方法 70只SD雄性大鼠，空白对照组(10只)正常饲养，其余60只采用改良连续腹腔注射阿霉素造模[10-11]复制大鼠心力衰竭模型，在经心脏彩超验证出现心力衰竭后，使用代谢笼验证所选模型大鼠具有水钠潴留症状，如体质量增加、脚趾肿胀和排尿减少等。在造模过程中5只大鼠死亡，对其解剖后均可发现存在脏器充血及多浆膜腔积液，待造模成功后将符合心力衰竭水钠潴留的48只大鼠随机分为模型对照组、养心颗粒治疗组(高剂量组、中剂量组、低剂量组)与阳性对照组(托伐普坦组)，各组实验大鼠均给予自由饮食，空白对照组和模型对照组以2 mL/d蒸馏水灌胃1次，养心颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组以养心颗粒16 g/kg、8 g/kg、4 g/kg剂量灌胃1次，阳性对照组灌服0.5 mg/kg托伐普坦，每日1次，均在8周后观察各项指标。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 一般情况 观察实验过程中各组大鼠的精神状态、活动情况、灵敏度、毛发情况、食欲、大小便等一般情况及死亡情况。

1.5.2 尿量、尿钠、尿渗透压检测 实验结束连续3 d收集各组大鼠24 h尿液，取均值，记录24 h尿量；采用冰点降低法测量大鼠尿渗透压，Na测试盒测量大鼠尿钠的排泄。

1.5.3 ELISA法检测血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP、Epac1和尿液AQP2水平 收集血液及尿液样本，常温离心机离心后取上清，于-70 ℃冰箱中冻存，收集齐所有标本后根据试剂盒说明书步骤操作。

1.5.4 心肌组织cAMP、Epac1及肾脏组织AQP2免疫组织化学测定 处死大鼠后，快速取出心脏及肾脏，用生理盐水将其冲洗干净，然后置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规酒精脱水、透明、石蜡包埋，连续切片，用于苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学分析。

2 结 果

2.1 一般情况 造模结束后至实验结束，空白对照组大鼠无死亡，模型对照组死亡2只，养心颗粒高剂量组死亡1只，中剂量组死亡1只，低剂量组死亡 1只，阳性对照组死亡2只。模型对照组大鼠毛色无光泽，倦怠乏力，精神萎靡，活动减少，反应迟钝，呼吸困难，活动后尤甚，肛温下降，口唇发暗，部分有瘀点瘀斑，大便稀溏。而养心颗粒治疗组与阳性对照组大鼠一般情况均较模型对照组改善、喘息不明显。

2.2 各组大鼠体质量比较 造模阶段，空白对照组大鼠体质量随着时间的增加而稳定增加，呈上升趋势。造模组用药初期(前4周)体质量增长较快，且可见脚趾肿胀，随着用药时间的增加，体质量增加缓慢。详见表1。造模结束后，空白对照组大鼠体质量增长明显，模型对照组大鼠体质量先增加后降低，养心颗粒高剂量组、中剂量组及阳性对照组体质量逐渐增加。用药治疗后，养心颗粒能对抗阿霉素引起的心脏毒性反应，减轻阿霉素导致的毒性症状。详见表2。

单位：g

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2.3 各组大鼠尿量、尿钠、尿渗透压比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠尿量、尿钠、尿渗透压均降低(P<0.05)，说明模型对照组大鼠水钠潴留明显。与模型对照组比较，养心颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组与阳性对照组大鼠尿量、尿钠、尿渗透压水平明显增加(P<0.05)。详见表3。

2.4 各组大鼠血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP、Epac1和尿液AQP2水平比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP及尿液AQP2升高(P<0.05)；与模型对照组比较，养心颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组与阳性对照组大鼠血NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP及尿液AQP2水平明显降低(P<0.05)，但Epac1水平各组间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

2.5 各组大鼠心肌组织cAMP、Epac1及肾脏组织AQP2表达水平比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠心肌组织cAMP、Epac1及肾脏组织AQP2表达明显升高(P<0.05)，与模型对照组比较，养心颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组与阳性对照组大鼠心肌组织cAMP、Epac1及肾脏组织AQP2的表达水平明显降低(P<0.05)。详见表5。

3 讨 论

当心力衰竭发生时，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、精氨酸血管加压素(AVP)等系统被激活，导致液体潴留，进一步加重心力衰竭，形成恶性循环。相关研究已证实，神经体液因子AVP在水钠潴留中发挥重要作用，血液中的AVP增加，导致AVPV2R激活，从而激发cAMP信号的级联反应，触发AQP2转移，使大量的AQP2集聚在管腔膜上，引起肾脏对水重吸收增加，进而导致水钠潴留[12-13]。但其具体机制而言，传统观点认为AVP诱导产生AQP2的主要信号通路是cAMP蛋白激酶A(PKA)途径，但随着进一步深入研究发现，通过抑制剂抑制PKA后，细胞内高浓度的cAMP仍然能发挥作用，cAMP的一种新的下游分子Epac可独立于PKA介导 cAMP信号通路[14-15]，但其是否参与AVP-AQP2调节水钠潴留目前尚不清楚，阻断该信号通路能否为治疗慢性心力衰竭水钠潴留带来新的思路，值得探究。

养心颗粒源自养心合剂，由桂枝、附子、车前子、麦冬、牛膝、丹参、泽泻、茯苓等药物组成，为陕西省已故名老中医王朝宏教授在长期临床应用的基础上创制，我院在配方不变的基础上，采用现代先进的药物制剂技术制备成的院内颗粒制剂，主治心肾阳虚、血瘀水停的心衰病。在前期研究及预实验的基础上，本课题组采用阿霉素诱导心力衰竭水钠潴留大鼠模型，探讨养心颗粒对阿霉素致心力衰竭水钠潴留的作用。结果显示，养心颗粒能对抗阿霉素对心脏的毒性反应，减轻阿霉素导致的毒性症状。与模型对照组比较，养心颗粒各剂量组能够明显增加大鼠尿量、尿钠、尿渗透压水平，减轻水钠潴留。就其机制而言，本研究证实养心颗粒各剂量组能够明显降低大鼠血清NT-proBNP、AVP、AVPV2R、cAMP及尿液AQP2水平，在心肌组织cAMP、Epac1及肾脏组织AQP2表达的测定中发现，养心颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组能够降低大鼠cAMP、Epac1、AQP2在相关组织的表达，但本研究发现，与Epac1在心肌组织的表达不同，其血清水平在各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，考虑有两种可能：①血清中的Epac1水平还不能完全代表心肌组织中Epac1的浓度；②只有活化的Epac1才能促进水钠潴留的发生与发展。

综上所述，养心颗粒能够通过抑制AVP-cAMP-Epac1-AQP2通路核心分子的表达，减轻水钠潴留，这可能是该药治疗心力衰竭作用机制之一，进一步探讨其发挥疗效的物质基础及更深层次的作用机制，对提高临床疗效奠定理论支持、拓展其应用范围具有重要意义。