高压脉冲电场预处理普洱熟茶对SD大鼠体内活性氧(ROS)水平的影响

冷 彦，王 静，吴文斗，沈晓静，陈立佼，杨贺凯，吴 奇，王白娟*

(1.云南农业大学，云南 昆明 650201; 2.云南省有机茶产业智能工程研究中心, 云南 昆明 650201; 3.云南省高校智能有机茶园建设重点实验室，云南 昆明 650201)

【研究意义】国家标准《地理标志产品 普洱茶》(GB/T 22111-2008)中，将普洱茶定义为“普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志性保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶”[1]。研究表明，普洱茶具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、降脂[4-5]、降血糖[6]、抗疲劳[7]、提高免疫力[8]等多种保健功效，其中其抗氧化活性与多酚类化合物密切相关[9]。【前人研究进展】国内外普洱茶活性物质如茶多酚[10]、茶多糖、茶色素、茶皂素[11]等的化学特性与结构不断被阐明，但普洱熟茶的体内抗氧化研究的报道相对较少。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物，具有活泼和代谢迅速的特质[12]。ROS在生物体内参与信号转导、基因表达调控、免疫反应等过程，是机体有效防御系统的重要组成部分，但过量的ROS亦可对生物膜以及蛋白质、脂类等生物大分子造成氧化损伤[13]。田华燕[14]，徐丽娟[15]，王天禄[16]等通过实验研究发现茶褐素对DPPH自由基、ABTS+自由基和羟自由基均有显著的清除效果，具有较好的抗氧化活性。【本研究切入点】目前，活性氧作为信号分子的研究大多集中在其如何影响模式植物营养器官的生长发育，但对其在动物体内水平的调节机制尚未有报道。【拟解决的关键问题】高压脉冲电场(high voltage pulsed electric field，HPEF)处理技术是对位于2个电极板之间的物料不间歇地施加高压脉冲波进行处理的过程，研究表明，适当的HPEF条件可以提高普洱熟茶中茶多糖的提取速率和抗氧化活性[17]，提高茶多酚的抗氧化活性[18]。本研究以云南临沧三级普洱熟茶为材料，以适宜的高压脉冲电场及真空冷冻干燥技术处理后获得普洱熟茶速溶茶粉，采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)细胞内活性氧检测探针检测饲喂SD大鼠体内过氧化物水平变化，探究高压脉冲电场预处理普洱熟茶对SD大鼠体内过氧化物水平的影响及维持体内代谢平衡的可行性，为普洱茶中天然抗氧化剂的开发和应用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

云南临沧三级普洱熟茶(散茶)(云南福茶茶叶有限公司生产)；茶褐素，纯度≥0.7 g·g-1(云南十草木生物科技有限公司生产)；ROS试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)；SPF级雌性SD大鼠(昆明楚商科技有限公司提供)，8周龄，体质量(245±20)g。

DMC-200型高压脉冲电源及处理箱(大连鼎通科技发展有限公司生产)；多功能荧光酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司生产)；荧光显微镜(上海光学仪器厂生产)。

1.2 试验方法

1.2.1 确定HPEF预处理条件 将HPEF处理时间设置为55 min，频率分别为80、99、121、139、162 Hz，电压在12～22 kV，通过正交方式组合成55组，各组参数条件详见表1。按照国家标准《茶叶感官审评方法》(GB/T 23776-2018)中的审评方法进行HPEF处理茶样的感官审评[19]。感官审评结果：第45组(HPEF：12 kV/162 Hz/55 min)的感官品质最好，收敛性最好。因此，选择12 kV/162 Hz/55 min条件下HPEF处理的普洱熟茶作为动物试验材料。

表1 HPEF电压、频率的设置

1.2.2 制备速溶茶粉 采用真空冷冻干燥技术制备茶粉，分别取普洱熟茶和经过HPEF预处理过的普洱熟茶1 kg，沸水浸提3次(各次茶水比为1∶20、1∶20、1∶100)，浸提时间分别为10、20、25 min，合并3次浸提液，放入真空冷冻干燥箱进行干燥，待冰晶完全消失后，将干燥后的茶粉刮下并放入自封袋中密封保存，茶粉的得率约为25%。

1.2.3 试验设计 根据陈宗道等人研究推荐成人每日平均用茶量6 g，中国男女总平均体重60 kg，则成人每日用茶量为每千克体重0.1 g[20]。根据《保健食品功能评价》要求，本试验采用SD大鼠按人体推荐量的5倍作为最低剂量，中、高剂量分别为人体推荐量的10倍和20倍，即高、中、低剂量组分别给予普洱熟茶2.0、1.0和0.5 g·kg-1。取大鼠160只，按体重随机分为8组，每组20只。设置处理1，HPEF预处理高剂量组(2.0 g·kg-1·bw)；处理2，HPEF预处理中剂量组(1.0 g·kg-1·bw)；处理3，HPEF预处理低剂量组(0.5 g·kg-1·bw)；处理4，未预处理普洱熟茶高剂量组(2.0 g·kg-1·bw)；处理5，未预处理普洱熟茶中剂量组(1.0 g·kg-1·bw)；处理6，未预处理普洱熟茶低剂量组(0.5 g·kg-1·bw)；处理7(CK1)，空白对照组，饲喂清水；处理8(CK2)，阳性对照组，饲喂茶褐素(1.0 g·kg-1·bw)。采用灌胃给药，空白组的大鼠给以相当量的饮用水，灌胃时间为每天17:00-19:00时。分别在4周和8周后，检测大鼠肝、肾、心、脑组织内ROS水平。

1.2.4 指标测定 按ROS测试盒说明书操作，活杀老鼠，取肝、肾、心、脑，在预冷的PBS中清洗血迹和其他污染物，用眼科剪将组织块剪碎，将组织放300目尼龙网上轻搓，边搓边用PBS冲洗，直至将组织搓完。收集细胞悬液，500 r/min离心10 min取上清液，并用PBS清洗1～2次，并重悬制备单细胞悬液，细胞计数。

Q=(M÷4)×104×N

式中：Q表示细胞数，个·mL-1；M表示显微镜视野中细胞总数，个·mL-1；N表示溶液稀释倍数。

向Q≤106的单细胞悬液中加入DCFH-DA，浓度为10 μmol/L，37 ℃孵育细胞30 min，1000 r/min离心收集细胞沉淀物用于荧光检测。荧光检测激发波长设置为500 nm，发射波长设置为525 nm。结果用荧光强度/组织鲜重(f·mg-1)表示。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0和DPS 9.01软件进行统计分析，利用Duncan新复极差法进行方差分析与多重比较，Excel 2016软件绘图。

2 结果与分析

2.1 ROS检测结果

如表2所示，4周后各组织中处理1～6的ROS水平均低于处理7(CK1)，表明普洱熟茶能降低大鼠肝、肾、心、脑组织中的ROS水平，且同一条件下的3个不同处理ROS水平随普洱熟茶剂量的增加而降低。各组织中ROS水平处理1均低于处理8(CK2)，表明HPEF高剂量处理能达到茶褐素对ROS的抑制效果。各组织中未预处理组的ROS水平均比处理8(CK2)高，表明未预处理的普洱熟茶达不到茶褐素对ROS的抑制效果。

表2 大鼠肝、肾、心、脑组织中ROS水平(4周后)

肝脏组织ROS水平处理1、处理2极显著低于处理7(CK1)，分别降低了23.48%、19.62%；处理3、处理4显著低于处理7(CK1)，分别降低了15.21%、13.26%；处理2极显著低于处理5，处理3显著低于处理6，表明肝脏组织中HPEF预处理组效果优于未预处理组。肾脏组织ROS水平处理1—处理4均极显著低于处理7(CK1)，分别降低了59.81%、57.74%、53.36%、40.92%，处理5比处理7(CK1)显著降低了27.06%；处理2显著低于处理5，处理3极显著低于处理6，表明肾脏组织中HPEF预处理组效果优于未预处理组。相比于处理7(CK1)，心脏组织ROS水平处理1极显著降低了29.38%，处理2显著降低了25.71%，表明心脏组织中HPEF高、中剂量组能较好地降低ROS水平。脑组织ROS水平处理1～5均极显著低于处理7(CK1)，分别降低了64.07%、58.84%、53.48%、35.26%、29.21%；处理1极显著低于处理4，处理2极显著低于处理5，处理3极显著低于处理6，表明脑组织中HPEF预处理组效果明显优于未预处理组(P<0.01)。

如表3所示，8周后各组织中处理1～6的ROS水平均低于处理7(CK1)，表明普洱熟茶能降低大鼠肝、肾、心、脑组织中的ROS水平，且同一条件下的3个不同处理的ROS水平随剂量的增加而降低。8周后，肾脏和脑组织的HPEF预处理组优于同剂量的未预处理组。肾脏、心脏和脑组织中处理1和处理2 ROS水平均低于处理8(CK2)，表明在肾脏、心脏和脑组织中HPEF高、中剂量处理能达到茶褐素对ROS水平的抑制效果；未预处理组ROS水平均比处理8(CK2)高，表明未预处理普洱熟茶达不到茶褐素对ROS的抑制效果。

表3 大鼠肝、肾、心、脑组织中ROS水平(8周后)

肝脏组织ROS水平处理1、处理2极显著低于处理7(CK1)，分别降低了24.51%、20.67%；处理3、处理4显著低于处理7(CK1)，分别降低了16.90%、15.09%，表明在肝脏组织中HPEF预处理组和未预处理组的高剂量处理可以较好的降低ROS水平。肾脏组织ROS水平处理1～5均极显著低于处理7(CK1)，分别降低了63.20%、60.41%、55.91%、44.14%、30.91%；处理2极显著低于处理5，处理3极显著低于处理6，表明肾脏组织中HPEF预处理组效果优于未预处理组。心脏组织ROS水平处理1、处理2显著低于处理7(CK1)，分别降低了37.91%、31.97%，表明心脏组织中HPEF预处理组高、中剂量处理可以较好的降低ROS水平(P<0.05)。脑组织ROS水平处理1～6均极显著低于处理7(CK1)，分别降低了68.24%、64.17%、57.67%、45.97%、36.21%、20.58%；处理1极显著低于处理4，处理2极显著低于处理5，处理3极显著低于处理6，表明脑组织中HPEF预处理组效果明显优于未预处理组(P<0.01)。

2.2 ROS水平随时间变化差异

如图1所示，各组织中处理7(CK1)的ROS水平随着处理时间的增加而逐渐增加，处理1～处理6和处理8(CK2)随着处理时间的增加则均有不同程度的降低。各组织中，只有脑组织中处理7(CK1)的ROS水平8周的显著高于4周的，高5.49%，其余组织中4周和8周的ROS水平均无显著差异，表明只有脑组织中处理7(CK1)ROS水平随时间变化差异显著(P<0.05)。

不同小写字母表示同一处理4周和8周差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同一处理4周和8周差异极显著(P<0.01)，4周时差异性标注在上，8周时差异性标注在下

3 讨 论

高压脉冲电场是非热处理领域研究的热点之一，适当的HPEF条件可以显著降低普洱茶中的细菌总数[21]、提高普洱茶茶水浸出物含量[22]、降低总灰分含量[23]、降低咖啡碱含量[24]、提高氨基酸含量[25]、提高香气主要成分含量[26-27]，提高普洱熟茶的体外抗氧化活性[28]。ROS是生物系统中产生的化学活性分子，是基本代谢过程的自然产物，然而，过量ROS的存在可导致脂质过氧化、DNA损伤，甚至诱导细胞死亡[29]。组织中ROS水平已被用作疾病标志物，而控制ROS水平可能是ROS诱导损伤的一种有希望的治疗策略[30]。王迪[31]研究了普洱茶水提取液对大鼠肝脏组织中ROS水平的影响，发现普洱茶水提取液可以降低肝脏组织中ROS水平，且呈剂量依赖降低型。陈晓扬等[32]探讨了茶多酚对脑组织中ROS的影响，发现茶多酚可以降低脑组织中ROS的水平。

本试验采用检测大鼠体内ROS的方法评价不同HPEF条件处理的普洱熟茶的抗氧化功效，与王亚男等[33]检测方法类似。大鼠肝、肾、心、脑组织内ROS水平检测结果表明，HPEF预处理组和未预处理组的ROS水平均较空白组低，且剂量越高ROS水平越低，表明普洱熟茶具有降低SD大鼠体内ROS的作用，这可能与普洱茶中含有的多酚类化合物有关，多酚类化合物可清除体内过量自由基，避免生物大分子损伤，可捕获氧化链式反应中产生的活性氧，减少链式反应的长度，插入或减慢缓慢过氧化地进行，这与王蕊等[34]的研究结果类似。HPEF预处理后的普洱熟茶降低ROS水平的功效均优于未预处理的普洱熟茶，这可能是由于HPEF能够引起细胞破损，使普洱熟茶中有效成分增加，这与梁荣[35]的研究结果类似。处理条件相同的茶样组都以灌胃时间久的ROS水平更低，可能是因为普洱熟茶中的多酚类化合物经氧化发酵衍生为较大分子，该大分子具有一定活性的聚合物所致。4周后的肝脏、肾脏组织和8周后的肾脏组织中，HPEF预处理高剂量组和未预处理高剂量组无显著差异，可能是因为HPEF预处理高剂量组达到了肝脏和肾脏的耐受力，其抗氧化能力达到了最高，当超过这个耐受力值有可能产生促氧化作用[36]，肝脏和肾脏组织的具体耐受力值有待进一步探究。8周后的肝脏组织HPEF预处理组和未预处理组无显著差异，可能是随着处理时间的增加，普洱熟茶中的多酚类物质减少[37]。4和8周后的心脏组织，仅有HPEF高、中剂量组明显低于空白组，其余组别无显著差异，且HPEF预处理组和未预处理组无显著差异，这可能是对于心脏组织而言试验组的剂量较低，后续可以增加心脏组织的剂量浓度，进一步探究不同剂量对SD大鼠心脏组织ROS水平的影响。

4 结 论

试验中，HPEF预处理组、未预处理组与空白对照组相比ROS水平均下降，并在一定条件下差异性达到显著或极显著水平。因此，HPEF预处理组和未预处理组均能增强大鼠体内的抗氧化能力，且HPEF预处理后的普洱熟茶在降低ROS水平的功效优于未预处理的普洱熟茶，剂量越高ROS水平越低。