狼疮性肾炎肾组织中β-catenin、TIMP-1 mRNA和蛋白的表达水平与预后关系研究

蒲改元，郭萌，王明浩

通用环球中铁华州医院肾内科，陕西 渭南 714100

系统性红斑狼疮是一种由自身抗体、免疫复合物或细胞因子作用引起的自身免疫性疾病，其发病率女性高于男性。系统性红斑狼疮涉及多种器官损害，其中肾脏是最常见累及器官。当系统性红斑狼疮累及肾脏时可导致患者并发狼疮性肾炎。遗传、性激素、环境、感染、免疫反应等均可诱导狼疮性肾炎发生[1]。Dinesh等研究表明，β-连环素(β-catenin)在类风湿性关节炎风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞中表达显著升高，可促进疾病进展[2]。卢珍梅等[3]研究报道，金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)在免疫性脑脊髓炎中表达上调，可能通过促进巨噬细胞分泌炎症因子，促进疾病发展。另有研究证实，下调TIMP-1表达可改善免疫性肝纤维化[4]。由于β-catenin和TIMP-1表达水平与狼疮性肾炎患者预后关系未有研究，本研究通过检测狼疮性肾炎肾组织中β-catenin、TIMP-1 mRNA和蛋白表达水平，分析两者与狼疮性肾炎与患者预后关系，探究两者在狼疮性肾炎疾病进展中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年6月至2018年6月通用环球中铁华州医院肾内科收治的狼疮性肾炎患者96例(观察组)，收集其肾活检组织，其中男性22例，女性74例；年龄25～51岁，平均(32.54±11.18)岁。根据国际肾脏病学会和肾脏病理学会病理分型标准[5]分为Ⅱ型23例，Ⅲ型36例，Ⅳ～Ⅴ37例；根据系统性红斑狼疮疾病活动度(systemic lupus erythematosus disease activity，SLEDAI)评分表分为＞9分61例，≤9分35例。纳入标准：①根据诊断标准及肾组织切片活检，确诊为狼疮性肾炎；②临床及随访资料完整。排除标准：①入组前接受过激素治疗；②合并膜性病变；③合并患有原发性心血管、神经系统、肝脏等疾病。另选取本院收治的96例肾肿瘤患者距病灶＞2 cm以上的正常肾组织为对照组，对照组患者未合并高血压、糖尿病，其中男性19例，女性77例；年龄24～76岁，平均(31.72±10.85)岁。两组患者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 荧光定量PCR仪(7500 Fast，美国ABI公司)，荧光定量PCR试剂盒(货号：RR820A，日本TaKaRa公司)，免疫组织化学染色试剂盒(货号：JM3920，上海优予生物科技有限公司)，总RNA提取试剂盒(货号：RP2401，北京百泰克生物技术有限公司)，反转录试剂盒(货号：K1622，美国Thermo公司)，兔抗人β-catenin多克隆抗体(货号：ABP0188，亚科因生物技术有限公司)，兔抗人TIMP-1多克隆抗体(货号：E-AB-33105，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，羊抗兔IgG二抗(货号：SSA004，北京泽平科技有限责任公司)。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 观察组患者在进行肾活检时收集肾组织，对照组于术中收集正常肾组织。一部分液氮迅速冷冻后于-80℃保存，用于实时荧光定量PCR实验；另一部分制成石蜡切片，用于免疫组织化学染色。需保证每个肾组织切片中至少有8个肾小球。

1.3.2 实时荧光定量PCR法检测β-catenin、TIMP-1 mRNA表达水平Trizol法提取总RNA后，经反转录获得cDNA，于-20℃保存，用于实时荧光定量PCR实验。反应体系(20μL)如下：2μL上游引物，2μL下游引物，2μL cDNA，10μL SYBR Primix ExTaq，0.4μL ROX DyeⅡ，6μL无酶水。反应步骤如下：①95℃，30 s，1个循环。②95℃，5 s；62℃，31 s，40个循环。一个样品三次重复，采用2-△△CT法计算β-catenin、TIMP-1 mRNA相对表达量。以GAPDH为内参基因，所用引物如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.3.3 免疫组织化学染色法检测β-catenin、TIMP-1蛋白表达水平 采用免疫组织化学染色法检测β-catenin、TIMP-1蛋白表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，实验最终所得切片在400倍显微镜下观察，并采集图象资料。

1.4 染色结果评分标准 细胞膜、细胞质中呈棕黄色或棕褐色为β-catenin、TIMP-1阳性细胞，分别根据阳性细胞百分比和染色强度评分。阳性细胞百分比：＜5%、5%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分别为0、1、2、3、4分。染色强度：无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别为0、1、2、3分。两种记分相乘，0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(＋)；5～8分为阳性(++)；9～12分为强阳性(+++)。(-)、(+)为低表达；(++)、(+++)为高表达。

1.5 随访 本研究入组患者经治疗出院后，以复查或电话形式随访2年，每3个月1次，随访至2020年6月截止。随访期间观察并记录患者肾存活率，并于第6个月记录患者是否获完全缓解。完全缓解定义为：血浆肌酐(SCr)正常或升高量≤基础值的30%，尿蛋白定量＜0.4 g/d，Alb≥35 g/L。SCr倍增殖与基线值比较，SCr持续升高1倍以上。终末期肾病指SCr持续(≥3个月)超过530.4μmol/L，或需肾脏替代治疗[7]。

1.6 统计学方法 应用SPSS22.0软件对本研究数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用配对t检验；计数资料比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier曲线分析其与狼疮性肾炎患者预后关系，采用Logistic法分析影响狼疮性肾炎患者不良预后的危险因素。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的β-catenin、TIMP-1蛋白表达水平比较β-catenin主要在细胞膜和细胞质中表达，TIMP-1主要在细胞质中表达。狼疮性肾炎患者肾组织中β-catenin、TIMP-1蛋白高表达率分别为69.79%、73.96%，明显高于对照组的35.42%、40.63%，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2和图1。

表2 两组患者的β-catenin、TIMP-1蛋白表达水平比较（例）

图1 两组患者的β-catenin、TIMP-1蛋白表达水平(400×)

2.2 两组患者的β-catenin、TIMP-1 mRNA表达水平比较 观察组患者肾组织中β-catenin、TIMP-1 mRNA表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 两组患者的β-catenin、TIMP-1 mRNA表达水平比较(±s)

表3 两组患者的β-catenin、TIMP-1 mRNA表达水平比较(±s)

组别观察组对照组t值P值例数96 96 β-catenin 6.57±2.14 1.03±0.32 25.086 0.001 TIMP-1 2.84±0.73 1.01±0.29 22.827 0.001

2.3 肾组织中β-catenin、TIMP-1蛋白水平与狼疮性肾炎患者临床特征的关系 肾组织中β-catenin、TIMP-1蛋白水平与狼疮性肾炎患者的性别、年龄无关(P＞0.05)。β-catenin、TIMP-1蛋白高表达患者随病理分型和SLEDAI评分增加而增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

2.4 不同β-catenin、TIMP-1蛋白表达水平狼疮性肾炎患者的预后比较β-catenin、TIMP-1高表达组患者6个月内获完全缓解、2年肾存活比例明显低于β-catenin、TIMP-1低表达组患者，而肾功能恶化、SCr倍增比例明显高于β-catenin、TIMP-1低表达组患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表5、表6。

2.5 影响狼疮性肾炎患者不良预后的危险因素 以Logistic回归分析结果显示，Ⅳ-Ⅴ型狼疮性肾炎、β-catenin高表达和TIMP-1高表达是影响狼疮性肾炎患者不良预后危险因素(P＜0.05)，见表7。

表4 肾组织中β-catenin、TIMP-1蛋白水平与狼疮性肾炎患者临床特征的关系(例)

表5 不同β-catenin蛋白表达水平狼疮性肾炎患者的预后比较[例(%)]

表6 不同TIMP-1蛋白表达水平狼疮性肾炎患者的预后比较[例(%)]

表7 影响狼疮性肾炎患者不良预后的危险因素

3 讨论

狼疮性肾炎患者会出现高血压、血尿、肾功能下降，也会出现肾功能衰竭，最终发展为终末期肾病，导致患者死亡[6-7]。探寻狼疮性肾炎预后标志物，对及时评估病情进展及改善患者预后有一定帮助。

β-catenin是一种多功能蛋白质，主要作为黏附因子调控细胞间信号转导。BRADFORD等[8]研究发现，β-catenin在溃疡性结肠炎组织中高表达，下调β-catenin表达可通过减少肠道祖细胞内信号转导，抑制炎症进展。本研究结果显示，观察组肾组织中β-catenin mRNA表达水平及蛋白高表达率均显著高于对照组，与β-catenin在溃疡性结肠炎中表达结果相似，提示β-catenin可能与狼疮性肾炎发生发展有关。肾纤维化是狼疮性肾炎患者主要临床特征[9]，WANG等[10]研究表明，β-catenin在肾纤维化过程中发挥重要作用，抑制其表达可有效控制肾纤维化发生。ALI等[11]在肾缺血再灌注损伤研究中发现，β-catenin可能与炎症因子相互作用，影响肾损伤发生。本研究结果显示，β-catenin蛋白高表达患者随病理分型和SLEDAI评分增加而增多，提示β-catenin可能通过调控炎症因子水平，影响肾纤维化过程，参与狼疮性肾炎进展。

TIMP-1与细胞增殖和转移有关。银屑病是一种由免疫异常引起的炎症性皮肤病。有研究表明，TIMP-1在银屑病患者血清中表达水平明显高于非银屑病患者，与银屑病进展中炎症介质调控通路有关[12]。本研究结果发现，与对照组相比，观察组肾组织中TIMP-1 mRNA及蛋白高表达率显著升高，与Amezcuaguerra在银屑病中研究结果一致，提示TIMP-1可能参与狼疮性肾炎进展。DONG等[13]研究发现，TIMP-1可通过促进肺成纤维细胞的增殖引起肺纤维化，影响肺损伤发生发展。有研究证实，糖尿病肾病中TIMP-1通过参与肾纤维化调控疾病进展[14]。WU等[15]研究表明，IL-33可通过调控TIMP-1在肺纤维化进程中发挥作用。本研究发现，TIMP-1蛋白表达水平与狼疮性肾炎病理分型和SLEDAI评分有关，提示TIMP-1可能通过与炎症因子相互作用，影响肾纤维化，调控狼疮性肾炎发生发展。

本研究还发现，与β-catenin、TIMP-1低表达组患者相比，β-catenin、TIMP-1高表达患者6个月内获完全缓解、2年肾存活比例均明显降低，肾功能恶化、SCr倍增比例明显升高，提示β-catenin、TIMP-1高表达可能影响狼疮性肾炎6个月内完全缓解率、患者肾存活率及肾功能恶化等。且Ⅳ～Ⅴ型狼疮性肾炎、β-catenin高表达和TIMP-1高表达是影响狼疮性肾炎患者不良预后危险因素，提示β-catenin和TIMP-1可能作为生物标志物，用于评估狼疮性肾炎患者病情及预后情况但具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，狼疮性肾炎患者肾组织中β-catenin、TIMP-1 mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常肾组织，与患者高病理分型、高SLEDAI评分及患者不良预后有关，可以作为预后标志物，为临床治疗方案确定及患者预后改善提供一定帮助。但由于本研究方法较为基础且样本量较少，具体机制尚需大量实验进一步探究验证。