系统性硬化症并间质性肺疾病与外周血T细胞亚群的相关性研究

李国铨，郭峰，王敏，叶凤，郑颜萍

海南医学院第一附属医院风湿免疫科，海南 海口 570100

系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)是一种异质性自身免疫疾病，其主要特征包括皮肤及内脏纤维化、免疫异常、闭塞性微血管损伤等，随着疾病的进展，可导致机体多器官纤维化，危及患者生命安全[1]。间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是SSc患者常见的并发症之一，也是最为严重的继发病症。有资料显示[2]，系统性硬化症并间质性肺疾病(systemic sclerosis associated interstitial lung disease，SSc-ILD)患者发病后的10年内致死率高达40%。目前，关于SSc-ILD的具体发病机制尚无报道明确阐述，但国内外诸多相关研究推动了SSc-ILD的发展，也增加了医学领域对该病症的认知。2016年雷玲等[3]报道指出SSc患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞比例增加，不同表型CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CD127-细胞比例与肺纤维化病变呈正相关性。VOLKMANN等[4]也指出SSc患者T淋巴细胞免疫功能紊乱、持续炎症反应等是导致SSc-ILD发病的重要因素。基于此，本研究分析了SSc-ILD与外周血T细胞亚群的相关性，以期为SSc-ILD的诊断和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年12月期间海南医学院第一附属医院风湿免疫科收治的40例SSc患者为研究对象，其中男性8例，女性32例；年龄24～78岁，平均(47.38±9.75)岁；病程6个月～19年，平均(3.12±0.92)年；临床症状表现：指端溃疡8例，雷诺现象27例，关节肿胀11例。入组标准：①均符合美国风湿协会SSc的分类标准[5]；②近半年内未使用过免疫抑制剂的已确诊患者或新发SSc患者；③患者及家属对检测内容、注意事项知情，且签署自愿参与书；④临床资料齐全；⑤依从性高。排除标准：①合并恶性肿瘤者；②存在急性感染者；③合并其他结缔组织病者；④因其他原因导致的药物性或特发性间质性肺病；⑤肝脏、心脏、脑、血液等重要脏器或系统患有严重疾病者。本研究已获得本院伦理委员会的审核批准。

1.2 方法

1.2.1 外周血T细胞亚群水平检测 采用EDTA-K2抗凝真空采血管抽取患者清晨空腹状态下静脉血2 mL。取一支流式专用管，加入20μL的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC/CD45-PC7四色试剂和100μL全血，充分混匀，在温室下避光孵育15 min。随后加入2 mL的FACELysing溶血液，避光孵育10 min，在1 500 r/min条件下离心处理5 min，弃上清液。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，再离心处理5 min，弃上清液。最后加入PBS缓冲液重悬，以流式细胞仪测定各细胞比例，包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值。

1.2.2 高分辨率CT(HRCT)检查 采用西门子公司的64排螺旋CT扫描仪对所有入组患者进行HRCT检查。患者取仰卧位，双手抱头，在静息状态下深吸气后屏气，从胸廓入口至肺底进行扫描。参数设置：管电压120 kV，管电流200 mAs，扫描层厚5 mm，层距5 mm。检查完成后将获得的影像信息传输至后台工作站以iDose4迭代算法、Y-Detail方式、Standard(B)方式进行图像重建，观察肺部、纵隔及双肺门表现。根据HRCT征象可将ILD分为0级、1级、2级、3级。具体评价方式为：0级表示未合并ILD，检查结果无明显异常；1级表示疑似合并ILD，出现局部或单侧的磨玻璃、网状或斑片状阴影，累及区域＜5%；2级表示合并轻度ILD，出现非依赖性磨玻璃或网状阴影、弥漫性小叶中心结节、非肺气肿性囊肿、支气管扩张等改变，且这些改变可分布于任何肺叶区域，累及范围≥5%；3级表示合并重度ILD，胸膜下多叶纤维化，伴有蜂窝状和牵引性支气管扩张。为确保检查结果的客观性，所有患者HRCT评分均由2名经验丰富的影像学医师单独进行，若两者评分结果一致则纳入数据库，若两者意见相左，则加入第3名影像学医师进行讨论确定结果。

1.3 观察指标 (1)基本临床特征：根据SSc患者是否合并ILD分为SSc-ILD组和SSc-Non-ILD组，比较两组基本临床特征，包括性别、年龄、病程、吸烟史、临床表现等；(2)外周血T细胞亚群水平：比较SSc-ILD组和SSc-Non-ILD组患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值；(3)ILD分级与外周血T细胞亚群水平的相关性：分析HRCT征象下ILD分级与外周血T细胞亚群水平的相关性，评价SSc-ILD与外周血T细胞亚群的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件进行数据处理，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Pearson检验分析SSc患者ILD分级与外周血T细胞亚群的相关性；绘制受试者工作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲线，计算外周血T细胞亚群的曲线下面积(areas under curve，AUC)，并分析其对SSc-ILD的敏感性和特异性；均以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的基本临床特征比较 根据HRCT检查结果，40例SSc患者中合并ILD者16例，未合并ILD者24例，SSc-ILD的发病率为40.0%(16/40)。两组患者的年龄、性别、临床表现等基本特征比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，但SSc-ILD组患者病程长于SSc-Non-ILD组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组患者的基本临床特征比较

2.2 两组患者外周血T细胞亚群水平比较 两组患者的CD4+水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)；SSc-ILD组患者的CD8+水平明显高于SSc-Non-ILD组，CD3+、CD4+/CD8+水平明显低于SSc-Non-ILD组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。+

表2 两组患者的外周血T细胞亚群水平比较(±s)

表2 两组患者的外周血T细胞亚群水平比较(±s)

组别SSc-ILD组SSc-Non-ILD组t/χ2值P值例数16 24 CD3+(%)66.73±11.32 70.51±10.84 4.013 0.001 CD4+(%)36.61±8.74 37.24±7.95 0.428 0.556 CD8+(%)33.64±7.28 29.56±6.52 4.957 0.001 CD4+/CD8 1.13±0.25 1.58±0.35 4.435 0.001

2.3 SSc患者HRCT下ILD分级与外周血T细胞亚群的相关性 Pearson相关性检查结果显示，SSc患者ILD分级与CD3+呈负相关性(r=-0.755，P=0.000)，与CD4+无明显相关性(r=-0.020，P=0.351)，与CD8+呈正相关性(r=0.845，P=0.000)，与CD4+/CD8+呈负相关性(r=-0.659，P=0.000)，见图1～图4。

图1 SSc患者ILD分级与外周血CD3+水平分布散点图

图2 SSc患者ILD分级与外周血CD4+水平分布散点图

图3 SSc患者ILD分级与外周血CD8+水平分布散点图

图4 SSc患者ILD分级与外周血CD4+/CD8+水平分布散点图

2.4 外周血T细胞亚群对SSc-ILD诊断的敏感度和特异度 经ROC曲线分析结果显示，CD3+、CD8+、CD4+/CD8的AUC分别为0.745、0.797、0.667，具有良好的阳性参考价值。CD3+最佳截断值为67.65，敏感度为79.2%，特异度为68.4%；CD8+最佳截断值为32.70，敏感度为83.8%，特异度为71.1%；CD4+/CD8+最佳截断值为1.29，敏感度为75.0%，特异度为73.7%，见表3、图5。

图5 SSc-ILD中外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的ROC曲线图

表3 SSc-ILD中外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+的ROC曲线分析结果

3 讨论

作为一种弥漫性结缔组织病，SSc常累及肺部、消化道等重要脏器，其中合并ILD的发生率高达25%～90%，严重影响患者预后[6]。受限于SSc-ILD发病机制仍不明确，临床在治疗SSc-ILD时往往没有准确的目标，不但增加医疗支出，并且可能出现各种药物相关的不良反应。目前，SSc-ILD的治疗方案主要包括免疫抑制剂、抗纤维化药物等，实际治疗效果和用药安全性欠佳[7]。因此，有学者提出，了解SSc-ILD患者机体各细胞因子、信号通路、免疫系统之间的相互联系，提高SSc-ILD的认知和理解，对寻求新的治疗靶点、治疗方向至关重要[8]。

本研究主要探讨了SSc-ILD与外周血T细胞亚群之间的关系，分析T淋巴细胞免疫应答对SSc-ILD发病的影响，并评估其机体免疫状态，以期为SSc-ILD患者制定科学、合理的治疗方案。通常而言，人体正常情况下的T淋巴细胞亚群水平维持在一个平衡状态，发挥着正常的免疫功能，当机体发生病变时，可能导致T淋巴细胞亚群发生不同程度的改变，客观地反映出机体免疫状况。AYANO等[9]学者指出，ILD发生与自身免疫损伤有关，在弥漫性肺疾病时，CD8+被认为可依据抗原刺激发挥细胞毒性或抑制作用。另外，在国内的一项研究中，张亮等[10]学者分析了结缔组织病并间质性肺病变(CTD-ILD)患者外周血T细胞亚群，指出CTD-ILD患者的CD8+水平明显升高，认为体内发生免疫功能的紊乱是导致CTD-ILD发生的重要危险因素，这与本研究结果相似。在免疫学上，CD3表示总T细胞水平，CD4+/CD8+则是机体免疫调节的核心环节，一旦失衡说明机体细胞免疫功能发生异常改变[11]。但是，在国内外相关报道中，关于外周血T淋巴细胞亚群水平与SSc-ILD的相关性尚无系统性研究，这也是本研究的主要目的之一。通过对确诊SSc患者进行胸部薄层CT及外周血T细胞亚群检测，评价T细胞研究在SSc-ILD发病中的作用。

本研究中，SSc-ILD组患者的CD8+水平明显高于SSc-Non-ILD组，CD3+、CD4+/CD8+水平低于SSc-Non-ILD组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，说明SSc-ILD患者免疫细胞分布异常，T细胞亚群失衡，导致体内发生明显的免疫功能紊乱。此外，国内诸多学者研究了淋巴细胞免疫分型与间质性肺疾病的关系[12-13]，指出SSc-ILD、单纯SSc以及健康对照组之间的CD3+、CD4+/CD8+均存在显著性差异，说明T细胞亚群失衡可能参与了该疾病的进展。但上述研究并没有对SSc-ILD疾病分级与T细胞亚群的关系进行探究，也缺少这类指标对SSc-ILD临床诊疗的价值评估。为了进一步探讨外周血T细胞亚群水平与SSc-ILD的关系，本研究基于HRCT对SSc患者进行ILD分级，并分析了其与外周血T细胞亚群的相关性。结果显示，SSc患者ILD分级与CD3+、CD4+/CD8+呈负相关性(r=-0.755、-0.659，P＜0.05)，与CD8+呈正相关性(r=0.845，P=0.000)，由此可见机体免疫功能状况与SSc-ILD的发生、进展密切相关，这在王妞[14]的研究中也得以体现。该结果无疑为临床治疗SSc-ILD提供了有建设性的参考依据：SSc合并ILD时，机体外周血T细胞亚群数量或功能发生改变，若在该阶段进行针对性的免疫学异常干预，可能有利于提高系统性硬化病和肺部病变的治疗效果，进而改善患者预后。

SSc-ILD起病隐匿，患者在发病初期缺乏特异性临床表现，容易出现误诊、漏诊，部分患者在确诊时已发展为不可逆的肺纤维化，造成严重的肺功能损伤。因此，早期给予有效的临床诊断具有重要的意义。HRCT是诊断SSc-ILD的有效手段，可取得与ILD病理学检查一致的结果。也有学者证实了血清趋化因子-4[15]、中性粒细胞-淋巴细胞比率[16]在SSc-ILD中的诊断价值。本研究通过绘制ROC曲线分析显示，CD3+、CD8+、CD4+/CD8+水平的对SSc-ILD的AUC分别为0.745、0.797、0.667，具有良好的阳性参考价值(AUC均＞0.5)，且敏感度、特异度良好，提示外周血T细胞亚群水平检测可作为临床诊断SSc-ILD的有效指标，对早期筛查SSc-ILD可能具有辅助性作用。刘培培等[17]研究了淋巴细胞免疫分型对ILD的临床价值，指出外周血T淋巴细胞亚群改变有助于临床识别免疫性损伤引发的结缔组织病相关间质性肺病变，与本研究结论相符。

综上所述，SSc患者免疫功能紊乱与其并发ILD密切相关，外周血CD3+、CD8+、CD4+/CD8+水平改变不仅对SSc-ILD病情评估和临床诊断具有重要的价值，同时对该疾病的治疗和预后有一定的指导性意义。但本研究存在一定的不足之处，如病例纳入数较少，且为单中心研究，病例均来自海南省，可能存在统计学误差及地域性差异；此外，未深入探究外周血T细胞亚群与SSc-ILD患者脏器受累、疗效检测及预后之间的关系，需要后续继续深入研究。