LncRNA-H19靶向miR-654-5p对人骨髓间充质干细胞成骨分化的促进效应研究

蒋励，许耀，王世龙，汤超亮，陈文钧

复旦大学附属华山医院骨科，上海 200040

骨折是骨科及手足外科等创伤修复科室常见疾病，多由于损伤部位多样、成因复杂及累计人群广泛等原因给患者和家庭带来经济负担和身心障碍。尽管骨的愈合能力较强，但仍有10%的骨折愈合会受到神经营养和感染等因素引起的骨坏死、骨缺损、骨髓炎等并发症的影响[1]。因而探索成骨调节机制及骨组织形成的生理过程可为临床骨折的治疗提供新的靶点及策略。

成骨分化涉及生长因子、信号通路及调控基因等多种因素，多种信号通路的共同影响可介导和调控骨髓间充质干细胞的分化[2]。随着基因测序技术的研究开展，有研究发现长链非编码RNA H19(long non coding RNA H19，LncRNA-H19)可参与成骨组织的细胞增殖、分化和调节活性的过程，亦有文献提示萎缩性骨不连组织的miR-654-5p的表达与正常骨痂组织显著上调，提示与成骨分化具有密切联系[3-4]。本研究通过观察LncRNA-H19靶向miR-654-5p对人骨髓间充质干细胞成骨分化的促进效应，以探讨其在成骨分化中的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取20只SPF级5～6周龄近交系BALB/c小鼠，雌雄各半，体质量18～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可：SCXK(京)2016-0011。适应性喂养1周，光暗周期12 h，室温20℃～24℃，湿度45%～50%，自由摄食及饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞分离及培养 (1)分离：小鼠颈椎脱臼处死，手术剪分离小鼠皮肤和肌肉，暴露胫骨和股骨并取下置于含磷酸盐缓冲液(PBS)的培养皿中冲洗3次；另取培养皿加入青链霉素双抗(1%)及FBS(10%)DMEM培养基，无菌剪剪断小鼠胫骨和股骨暴露骨髓腔，1 mL无菌注射器吸取培养皿反复冲洗，直至流出液体为清亮、发白的骨颜色；移液器将含小鼠骨髓液的培养皿转至15 mL离心管中，无菌网过滤后1 000 r/min进行5 min离心；弃去上清液后加入DMEM培养基，接种于培养瓶中于细胞培养箱(37℃、CO25%)培养，每隔2 d换培养基一次。(2)培养：显微镜观察培养瓶中细胞，出现80%的融合时即可进行传代操作；移液器取出原有培养液后加入1 mL含EDTA(0.02%)的胰蛋白酶(0.25%)至培养瓶中，盖好瓶盖后置于细胞培养箱(37℃、CO25%)消化2 min并观察消化过程直至细胞脱离瓶底，移液器吹打液体变成单个细胞后进行1 000 r/min进行5 min离心并弃去上清液，细胞液移至新的培养瓶中进行1∶2比例传代，再加入5 mL培养基后重新放入细胞培养箱中培养。

1.2.2 分组 将骨髓间充质干细胞随机分为阴性对照组、LncRNA-H19转染组和LncRNA-H19抑制组，LncRNA-H19转染组转染LncRNA-H19慢病毒载体、LncRNA-H19沉默质粒。

1.2.3 MTT法检测 取第3、5、7代对数生长期的mBMSCs细胞进行MTT试验，胰蛋白酶消化后制成悬液，细胞计数后5×103/孔加入96孔板中，放回细胞培养箱；第2天每孔加入20μL MTT溶液，4 h的37℃孵育，吸除孔内上清液，加入100μL DMSO后10 min震荡，酶标仪检测490 nm波长的各孔吸光度值，分光光度计测量OD值。

1.2.4 ALP活性测定 取第3～5代对数生长期的mBMSCs细胞进行ALP活性测定，1 000 r/min进行5 min离心后取0.5 mL上清液使用全自动生化分析仪测定ALP活性。

1.2.5 荧光素报告基因实验[5]取第3～5代对数生长期的mBMSCs细胞接种于24孔板中，每孔6×104个细胞，置于细胞培养箱(37℃、CO2、5%)过夜培养；配置miRNA转染的混合液后每孔加入500μL的无双抗血清的Opti-MEM减血清培养基，均匀加入Mimics转染混合液，置于24孔板中细胞培养箱(37℃、CO2、5%)过夜培养；每孔转入载体质粒200 ng后室温孵育20 min，每孔加入500μL的无双抗血清的Opti-MEM减血清培养基后均匀加入荧光素酶载体混合液；24孔板培养液弃除后加入α-MEM培养基进行24 h培养；24孔板培养液弃除后每孔加入裂解液将细胞裂解；每孔混合液转移至1.5 mL棕色瓶中，转移至96孔板中，每组设3个复孔，酶标仪检测吸光度。

1.2.6 Western blot检测 提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取20μg蛋白经SDS×缓冲液上样混合变性后进行SDS-PAGE胶电泳并切胶、转膜；TBST溶液室温2 h封闭，封闭液弃去，加入大鼠抗人磷酸化BMP-2、OCN蛋白多克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜；洗膜后；辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG二抗孵育后洗膜进行显色反应，曝光后显影；β-actin为内对照。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件分析数据，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用F检验，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况 阴性对照组、LncRNA-H19转染组和LncRNA-H19抑制组细胞培养0 h、24 h、48 h及72 h时OD值比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.2 各组ALP活性测定比较 LncRNA-H19转染组ALP活性值明显高于阴性对照组和LncRNA-H19抑制组，差异有统计学意义(P＜0.05)；LncRNA-H19抑制组ALP活性值明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表1 各组细胞不同培养时间OD值比较(±s)

表1 各组细胞不同培养时间OD值比较(±s)

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注：与阴性对照组比较，a P＜0.05；与LncRNA-H19转染组比较，b P＜0.05。

2.3 LncRNA-H19对miR-654-5p-3'UTR序列的靶向作用 LncRNA-H19转染组miR-654-5p-3'UTR调节的荧光素酶活性明显低于阴性对照组和LncRNA-H19抑制组，差异有统计学意义(P＜0.05)；LncRNA-H19抑制组miR-654-5p-3'UTR调节的荧光素酶活性明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；各组miR-654-5p-突变型3'UTR调节的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

2.4 各组蛋白相对表达量比较 LncRNA-H19转染组BMP-2、OCN蛋白相对量明显高于阴性对照组和LncRNA-H19抑制组，差异有统计学意义(P＜0.05)；LncRNA-H19抑制组BMP-2、OCN蛋白相对量明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4和图1。

表3 LncRNA-H19对miR-654-5p-3’UTR序列的靶向作用(±s)

表3 LncRNA-H19对miR-654-5p-3’UTR序列的靶向作用(±s)

注：与阴性对照组比较，a P＜0.05；与LncRNA-H19转染组比较，b P＜0.05。

组别阴性对照组LncRNA-H19转染组LncRNA-H19抑制组F值P值miR-654-5p-3'UTR荧光素酶活性1.010±0.100 0.612±0.099a 1.453±0.102ab 15.583 0.001 miR-654-5p-突变型3'UTR荧光素酶活性1.004±0.091 1.010±0.082 1.005±0.090 0.544 0.801

3 讨论

干细胞再生医学及骨组织工程领域内骨髓间充质干细胞具备良好的增殖能力和多潜能分化能力，在组织损伤修复领域具有很大的潜力，可在一定条件下诱导成骨分化，从而促进形成新生骨组织，近年来已逐渐被应用于重建组织或器官的功能或促进组织器官的再生及加快创伤的愈合，但相关机制尚未完全明晰[6-9]。

作为最早被鉴定的lncRNA分子，H19参与哺乳动物各组织细胞周期、生长、分化的调控，对许多靶基因也发挥着重要的调节作用，相关文献提示Lnc RNA H19可促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，并抑制成脂过程，但介导的相关通路和相关机制尚不明确[10-12]。本研究通过各代细胞进行MMT法检测细胞增殖能力发现阴性对照组、LncRNA-H19转染组和LncRNA-H19抑制组细胞培养0 h、24 h、48 h及72 h时OD值比较差异无统计学意义，因此为确保实验效率和增殖活力，本研究取第3～5代培养对数生长期的mBMSCs细胞进行了下一步研究。

骨源性碱性磷酸酶已被证实是反映骨代谢情况的最重要指标之一，其由成骨细胞合成，人体血钙下降及甲状旁腺功能上升后可使成骨细胞向活性状态转变，进而促进骨源性碱性磷酸酶释放入血[13-14]。本研究结果显示LncRNA-H19转染组ALP活性值明显高于阴性对照组和LncRNA-H19抑制组；LncRNA-H19抑制组ALP活性值明显低于阴性对照组。上述结果提示LncRNA-H19具有促进成骨细胞活化的作用，进而促进ALP的分泌和活性的提高。

已有文献提示lncRNAs通过与miRNAs相互结合来阻断miRNA对靶基因的调控，从而影响下游靶基因的表达[15]。动物实验研究发现miR-654-5p的高表达可增加骨质疏松症的患病风险，同时发现miR-654-5p在成骨或成脂分化的表达有明显差异[16]。上述研究均提示miR-654-5p具有成为调节人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。本研究结果显示LncRNA-H19转染组miR-654-5p-3'UTR调节的荧光素酶活性明显低于阴性对照组和LncRNA-H19抑制组；LncRNA-H19抑制组miR-654-5p-3'UTR调节的荧光素酶活性明显高于阴性对照组。荧光素酶报告检测系统经常用于RNA结合靶点的验证，通过本研究发现LncRNA-H19被沉默而表达下调后引起了miR-654-5p表达上调，反过来主动过表达miR-654-5p则不引起LncRNA-H19变化；而miR-654-5p的过表达或抑制使对应的LCoR水平发生相反变化，反之LCoR并不存在调控miR-654-5p的功能。大量文献也提示LncRNA、mi RNA能够单向或互相调节影响靶基因表达水平而改变细胞分化命运，因此mi RNA可能通过指导靶RNA切割及翻译抑制等作用参与Lnc RNA的负调控过程[17-19]。

?组别阴性对照组LncRNA-H19转染组LncRNA-H19抑制组F值P值BMP-2蛋白相对表达量0.493±0.100 1.102±0.102a 0.202±0.082ab 23.392 0.001 OCN蛋白相对表达量0.372±0.094 1.242±0.088a 0.182±0.092ab 0.892 0.554?

图1 Western blot检测图注：A，LncRNA-H19抑制组；B，LncRNA-H19转染组；C，阴性对照组。

BMP-2能刺激DNA的合成和细胞的复制，从而促进间充质细胞定向分化为成骨细胞；OCN由分化成熟的成骨细胞合成和分泌，可以反映骨组织中骨钙蛋白的合成状况，被认为是成骨细胞向矿化发生期分化标记之一。本研究结果显示LncRNA-H19转染组BMP-2、OCN蛋白相对量明显高于阴性对照组和LncRNA-H19抑制组；LncRNA-H19抑制组BMP-2、OCN蛋白相对量明显低于阴性对照组。上述结果提示LncRNA-H19促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化，可能与调控MMP-2、OCN蛋白表达有关。研究证实BMP主要通过依赖Smad途径和p38-MAPK途径两条信号通路发挥作用，且信号转导过程受细胞外拮抗剂、膜受体、细胞质微环境和转录水平等多个层次的调节控制，因此LncRNA-H19促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化可能与通过介导Smad途径和p38-MAPK信号通路有关[20]，但相关机制还有待进一步证实。

本研究的创新点在于针对LncRNA-H19通过靶向作用的机制和相关通路进行了较深入的分析，为临床相关机制的确认提供了数据参考，但LncRNA-H19是否还存在其他机制尚未完全明确，还有待进一步研究探讨。综上所述，LncRNA-H19通过靶向miR-654-5p促进人骨髓间充质干细胞向成骨分化，可能与调控BMP-2、OCN蛋白表达有关。