miR-424靶向MEK1对白血病HL-60细胞系增殖、凋亡及阿霉素耐药性的影响

戴进前，倪庆仁，张韵洁，任婧婧，李光，张晓波，宋艳萍西安市中心医院西安市血液病研究所，陕西 西安 710003

白血病是人类造血干细胞发生恶性增殖的疾病，临床上主要表现为髓细胞白血病、混合细胞白血病、淋巴细胞白血病等[1-2]。根据疾病发生缓急可分为以早幼粒细胞为主的急性白血病和以成熟细胞为主的慢性白血病，而急性髓系白血病是临床上较为常见、死亡风险较高的一种血液系统恶性肿瘤[3]，给患者身体健康造成严重危害。目前，急性白血病主要通过化疗和造血干细胞移植的方法进行治疗，然而耐药现象和移植后排斥反应严重影响治疗疗效[4]。选择性免疫治疗和各种分子靶向治疗的发展逐渐成为白血病治疗研究的新方向。微小RNA(miRNA)是一种短链非编码RNA，在白血病中作为抑癌因子或癌基因发挥作用[5]。miR-424属于miR-16家族成员，是一种抑癌基因，在多种肿瘤细胞和组织中低表达，与肿瘤细胞的增殖、凋亡和耐药性有关，且在白血病患者治疗反应中起重要作用[6-7]。有研究表明miR-424可促进单核细胞白血病细胞系分化为成熟单核细胞和巨噬细胞，调控白血病细胞生长，促进细胞成熟，可以作为治疗白血病的潜在分子靶点[8]。本研究通过探索miR-424对白血病HL-60细胞增殖、凋亡及阿霉素(doxorubicin，ADM)耐药性的影响，并探讨其可能的作用机制，旨在为临床治疗提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试剂 正常人的外周血单核细胞PBMC(PCS-800-011)购自于美国ATCC细胞库；人原髓细胞白血病细胞HL-60(货号TCHu23)购自于中国科学院细胞库。ADM(货号T11090L)购自于美国TargetMol公司；qRT-PCR引物由上海吉玛生物公司设计合成；反转录试剂盒(货号K1622)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试 剂盒(货号11736059)购自于美国Thermo Fisher公司；Trizol(货号T9424)购自于美国Sigma公司；荧光素酶活性检测试剂盒(货号E2920)购自于美国Promega公司；荧光素酶报告载体由上汉恒生物公司提供；LipofectamineTM2000试剂盒(货号11668027)购自于美国Invitrogen公司；兔抗人单克隆丝裂原活化蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1)抗体(货号ab32091)、兔抗人多克隆Ki67抗体(货号ab15580)、兔抗人多克隆Bcl-2抗体、兔抗人多克隆Bax抗体(货号ab32503)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(货号：ab205718)均购自于英国Abcam公司。CCK8细胞增殖试剂盒(货号C0037)、Annex V-FITC凋亡试剂盒(货号C1062)、RIPA裂解液(货号P0013)、BCA蛋白检测试剂盒(货号P0012)购自于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器 酶标仪(型号SpectraMax iD3)购自于美国Molecular Devices公司；流式细胞仪(型号BD FACSCantoⅡ)购自于美国Becton-Dickinson公司，电泳仪(型号1658001)购自于美国Bio-Rad公司，CO2培养箱(型号CB53)购自于德国Binder公司，实时荧光定量PCR仪(型号ABI 7500)购自于美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 正常人的外周血单核细胞PBMC、白血病细胞HL-60分别以RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素)置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，2 d换液一次，0.25%的胰蛋白酶消化离心传代培养，取对数生长期细胞用于以下实验。

1.3.2 转染及分组 收集1.3.1中细胞PBMC、HL-60以密度为4×105个/孔、每孔2 mL接种于6孔板中，置于培养箱中培养，待细胞融合至70%时，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，将miR-424 NC、miR-424 mimic分别转染至HL-60细胞中，每组8个复孔，将细胞HL-30分为NC组、miR-424 mimic组，分别以仅添加新鲜培养液的HL-60细胞和PBMC细胞作为空白对照组和正常对照组。

1.3.3 qRT-PCR检测白血病HL-60细胞中miR-424、MEK1 mRNA相对表达水平 转染48 h后，收集1.3.2中PBMC及各组HL-60细胞，用Trizol法提取总RNA，根据引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物(序列如表1所示)，按照反转录试剂盒对RNA合成cDNA，按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配20μL反应体系并进行扩增。反应条件为：95℃预变性15 min，95℃变性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40个循环，以U6、GAPDH为对照，采用2-△△Ct法分析miR-424和MEK1 mRNA相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 CCK8检测白血病HL-60细胞增殖 收集1.3.2中各组HL-60细胞，并以密度2×104/孔每孔200μL，铺于96孔板，分别在转染24 h、48 h、72 h后加入CCK8试剂，按照CCK8试剂盒说明书进行操作，检测450 nm波长下各孔细胞吸光度值(OD)值，统计数据分析各组细胞的增殖情况。细胞相对增殖率=(转染组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.5 流式细胞术检测白血病HL-60细胞凋亡 收集1.3.2中各组HL-60细胞，按照Annex V-FITC凋亡试剂盒方法在流式细胞仪上检测每组细胞的凋亡率。

1.3.6 CCK8检测HL-60细胞对ADM的敏感性 收集1.3.2中各组细胞，每组分别加入含终浓度为0、0.08μmol/L、0.16μmol/L、0.64μmol/L ADM的培养基，继续培养48 h后按照CCK8试剂盒说明书检测各组细胞各孔细胞OD值，计算分析各组半数抑制浓度(IC50)。

1.3.7 双荧光素酶报告基因检测白血病HL-60细胞与MEK1的靶向关系 分别构建含有野生型MEK1的野生型和突变型3'-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒(MEK1-Wt和MEK1-Mut)。收集白血病HL-60细胞，调整细胞密度为2×105/孔，接种于24孔板中，miR-424 mimic或NC分别与MEK1-Wt质粒和MEK1-Mut质粒共同转染至白血病HL-60细胞，每组8个复孔，继续培养48 h。按照荧光素酶活性检测试剂盒操作说明对荧光素酶活性测定。

1.3.8 Western blot检测白血病HL-60细胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表达 收集1.3.2中各组HL-60细胞，PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液在冰水浴中处理，提取蛋白，BCA法测定各组蛋白的浓度，按照4∶1在蛋白中加5×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝胶配方表制备10%分离胶和5%浓缩胶，以每泳道30μg蛋白上样，蛋白凝胶电泳，根据蛋白Marker切胶，转膜，对抗体MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax均按照1∶500的比例稀释后4℃孵育过夜，放摇床1.5 h，TBST清洗，加入HRP标记的二抗，室温孵育并放摇床2 h，TBST清洗后，参考ECL发光液说明书对条带孵育、曝光、显影。Image J软件对条带灰度值进行分析。

1.4 统计学方法 应用SPSS23.0软件对数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差(x-±s)表示，多组计量数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中miR-424、MEK1 mRNA相对表达水平比较 与正常对照组相比，空白对照组、NC组HL-60细胞中miR-424相对表达水平显著降低，MEK1 mRNA相对表达水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与空白对照组、NC组相比，miR-424 mimic组HL-60细胞中miR-424相对表达水平显著升高，MEK1 mRNA相对表达水平显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组细胞中miR-424、MEK1 mRNA相对表达水平(±s，n=8)

表2 各组细胞中miR-424、MEK1 mRNA相对表达水平(±s，n=8)

注：与正常对照组比，a P＜0.05；与空白对照组比，b P＜0.05；与NC组相比，c P＜0.05。

组别正常对照组空白对照组NC组miR-424 mimic组F值P值miR-424/U6 1.01±0.15 0.46±0.13a 0.45±0.14a 1.09±0.16bc 45.046＜0.05 MEK1/GAPDH 1.03±0.23 1.72±0.32a 1.70±0.28a 1.25±0.25bc 12.579＜0.05

2.2 过表达miR-424对白血病HL-60细胞增殖能力影响 与空白对照组、NC组相比，同一时间miR-424 mimic组白血病HL-60细胞相对增殖率显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 miR-424过表达对白血病HL-60细胞相对增殖率的影响(±s，n=8)

表3 miR-424过表达对白血病HL-60细胞相对增殖率的影响(±s，n=8)

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与NC组相比较，b P＜0.05。

组别空白对照组NC组miR-424 mimic组F值P值24 h 99.98±13.31 98.32±12.85 55.18±12.01ab 31.825＜0.05 72 h 101.64±14.86 99.78±13.05 50.24±12.03ab 38.068＜0.05 48 h 100.12±13.01 98.99±12.78 52.19±11.01ab 39.566＜0.05相对增殖率(%)

2.3 过表达miR-424对白血病HL-60细胞凋亡能力影响 与空白对照组、NC组相比，转染48 h后miR-424 mimic组白血病HL-60细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 miR-424过表达对白血病HL-60细胞凋亡的影响(±s，n=8)

表4 miR-424过表达对白血病HL-60细胞凋亡的影响(±s，n=8)

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与NC组相比较，b P＜0.05。

组别空白对照组NC组miR-424 mimic组F值P值凋亡率(%)12.21±3.26 13.76±4.29 51.10±5.56ab 194.118＜0.05

2.4 过表达miR-424对白血病HL-60对ADM的敏感性 用药48 h后，在相同药物浓度下，与空白对照组组、NC组相比，miR-424 mimic组HL-60细胞IC50值显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

2.5 miR-424对白血病HL-60细胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与空白对照组、NC组相比，miR-424 mimic组HL-60细胞MEK1、Ki67、Bcl-2蛋白相对表达水平均显著降低，Bax蛋白相对表达水平均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1、表6。

表5 miR-424过表达对白血病HL-60细胞对ADM敏感性比较(±s，n=8)

表5 miR-424过表达对白血病HL-60细胞对ADM敏感性比较(±s，n=8)

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与NC组相比较，b P＜0.05。

组别空白对照组NC组miR-424 mimic组F值P值IC50(μmol/L)0.46±0.05 0.44±0.06 0.20±0.05ab 58.419＜0.05

图1 各组HL-60细胞中MEK1、Ki67、Bcl-2、Bax蛋白免疫印迹图

表6 各组HL-60细胞中MEK1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表达比较(±s，n=8)

表6 各组HL-60细胞中MEK1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表达比较(±s，n=8)

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与NC组比较，b P＜0.05。

组别空白对照组NC组miR-424 mimic组F值P值MEK1 0.88±0.11 0.89±0.13 0.30±0.10ab 70.215＜0.05 Ki67 0.77±0.08 0.80±0.09 0.29±0.07ab 101.320＜0.05 Bcl-2 0.73±0.06 0.76±0.07 0.35±0.06ab 103.603＜0.05 Bax 0.21±0.06 0.19±0.05 0.72±0.08ab 173.248＜0.05

2.6 miR-424与MEK1的靶标关系 如图2所示，microrna.org数据库预测MEK13'-UTR与miR-424存在结合位点。与miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR组比较，miR-424 mimic+WT-MEK1 3'-UTR组荧光素酶相对活性显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；miR-424 NC+MUT-MEK13'-UTR组、miR-424 mimic+MUT-MEK1 3'-UTR组荧光素酶相对活性差异无统计学意义(P＞0.05)，见表7。

图2 microrna.org数据库预测MEK1基因靶向图

表7 双荧光素酶报告实验验证miR-424与MEK1靶向关系(±s，n=8)

表7 双荧光素酶报告实验验证miR-424与MEK1靶向关系(±s，n=8)

注：与miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR组比较，a P＜0.05。

组别miR-424 NC+WT-MEK1 3'-UTR组miR-424 mimic+WT-MEK1 3'-UTR组miR-424 NC+MUT-MEK1 3'-UTR组miR-424 mimic+MUT-MEK1 3'-UTR组F值P值荧光素酶的相对活性2.47±0.22 1.69±0.13a 2.44±0.33 2.40±0.29 15.792＜0.05

3 讨论

白血病是由造血干细胞恶性克隆而引发的一种疾病，具有无限增殖、凋亡受阻、分化障碍等特点，造血干细胞在骨髓或其他造血组织中大量堆积，可以抑制造血功能，急性髓系白血病是临床多发性白血病，约占成人白血病的70%[9]，目前，通过手术和传统的化疗药(如ADM)在白血病中的治疗已难以达到预期的效果，随着生物分子学的发展，miRNA在白血病中的作用已成为近年来研究热点。

miR-424是一种抑癌基因，对细胞周期和凋亡具有调控作用，与血液恶性肿瘤发生发展有关。如KHARE等[10]研究发现弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血浆中miR-424的表达显著低于健康对照组。HERSHKOVITZ-ROKAH等[11]研究发现miR-424在慢性髓系白血病患者细胞系和血液中的表达均显著低于正常人，且miR-424过表达能够抑制人类髓系白血病细胞K562的增殖，诱导细胞的凋亡和对药物敏感。本研究发现，白血病细胞HL-60中miR-424表达显著低于PBMC细胞，提示miR-424可能与白血病发生有关。因此本研究通过体外培养白血病HL-60细胞系，探讨过表达miR-424对HL-60增殖、凋亡及耐药性的影响。

细胞增殖是细胞生命活动的基础，而肿瘤细胞是一种细胞周期失控、可无限增殖的细胞[12]。已有研究表明，Ki67在细胞间期和有丝分裂期都有重要作用，在无限增殖的细胞中高度表达，Ki67作为细胞的增殖标志物已经被广泛应用[13]。细胞凋亡和增殖处于动态平衡，抗凋亡基因Bcl-2过表达可使细胞凋亡过程受阻，而促凋亡基因Bax则可拮抗Bcl-2的生物学过程从而诱导细胞凋亡[14]。本研究发现，miR-424 mimic组HL-60细胞增殖率、Ki67蛋白相对表达水平显著低于空白对照组，提示miR-424过表达可抑制HL-60细胞增殖。本研究发现，miR-424 mimic组HL-60细胞增殖率、蛋白KI67、Bcl-2表达显著低于空白对照组，细胞凋亡率、Bax蛋白相对表达水平显著高于空白对照组，提示miR-424过表达可抑制细胞HL-60的增殖，促进细胞凋亡。机体的耐药性与细胞对药物的敏感性有关，阿霉素是临床治疗白血病的一线药物，而白血病细胞对该药物产生耐药性成为影响白血病化疗失败的重要因素[15]。研究发现，miRNA不仅参与癌症细胞增殖、分化、凋亡等生理过程，而且miRNA失调还影响癌细胞的耐药性[16]。本研究发现，miR-424 mimic组白血病HL-60细胞IC50值显著低于空白对照组，提示miR-424过表达促使HL-60细胞对ADM的敏感性增加，耐药性降低。

MEK1是丝裂原活化蛋白激酶家族重要成员，又称MAP2K1，在细胞增殖和凋亡中发挥作用[17]。有研究发现miR-16通过靶向抑制MEK1激酶1(MEK1)调节ERK/MEK1信号途径抑制肺癌细胞的增殖和侵袭[18]。此外，WANG等[19]研究发现miR-181a可靶向MAP2K1调节ERK/MAPK信号途径抑制白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡，降低白血病细胞对ADM的耐药性。本研究发现，与PBMC细胞相比，白血病HL-60细胞中MEK1的相对表达水平显著升高，提示MEK1可能与白血病的发生有关。本研究还发现过表达miR-424能够抑制HL-60细胞中MEK1的表达。miRNA通过与其下游靶基因3'-UTR区结合调节基因的表达。进一步采用TargetScan、microRNA.org、miRGene数据库预测miR-424靶基因，发现miR-424与MEK1存在结合位点，进一步采用双荧光素酶报告实验验证发现，WT-miR-424 mimic+MEK1 3'-UTR组的荧光素酶相对活性低于WT-miR-424 NC+MEK1 3'-UTR组，提示miR-424能够靶向MEK1，调控其表达，两者可能共同影响HL-60的发生及耐药性，具体机制有待进一步研究。

综上所述，上调miR-424可能通过靶向抑制MEK1表达，抑制白血病细胞HL-60的增殖，促进细胞凋亡，逆转细胞对阿霉素的耐药性，为白血病的靶向治疗提供新思路。本研究的不足之处在于没有用敲除或低表达miR-424的方法以验证沉默miR-424对HL-60细胞生物学活性及耐药性的调节是否能发生逆转，从而进一步确认miR-424调节白血病发生发展的作用。