去甲斑蝥素对人未分化甲状腺癌FRO细胞迁移、侵袭影响及机制研究

许景伟，樊 丽，岳丽玲，许瀚文

(1. 齐齐哈尔医学院附属第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161041；2. 齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3. 天津医科大学临床医学院，天津 300270)

甲状腺癌是近年来头颈部及内分泌系统常见的恶性肿瘤，据2017年全球数据统计，甲状腺癌位居女性恶性肿瘤的第五位[1]，其中未分化甲状腺癌虽然只占甲状腺癌的2%左右，但其恶性度极高，生长快、易转移、预后差[2]。目前临床上对未分化甲状腺癌尚无有效的治疗方法，是临床亟待解决的问题。斑蝥是芫青科昆虫南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas或黄黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的干燥虫体[3]。2000年前，斑蝥素就已经应用于抗肿瘤治疗，但是其对泌尿系统有明显毒副作用。去甲斑蝥素是在斑蝥素基础上去掉1,2位甲基，保留了其抗肿瘤及提高白细胞活性的作用，且可明显减轻对泌尿系统的毒性损伤作用[4]。本研究观察了去甲斑蝥素对人未分化甲状腺癌FRO细胞迁移和侵袭能力的影响及可能作用机制，旨在为其临床应用提供更多实验依据。

1 实验材料与方法

1.1材料 人未分化甲状腺癌FRO细胞(中科院上海生命研究院)；去甲斑蝥素 (贵州金桥药业有限公司)；DMEM培养基(美国Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8试剂盒、二甲亚砜(上海碧云天生物技术有限公司)；E-钙黏蛋白(E-cadherin)基质金属蛋白酶-9(MMP-9)兔抗人一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(美国ABclonal公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；细胞周期试剂盒(四正柏生物公司)；Turnel细胞凋亡试剂盒(碧云天生物科技有限公司)。

1.2细胞培养 复苏甲状腺癌FRO细胞，并接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37 ℃、 5% CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长后每2 d换液1次，生长达到90%孔底面积时经胰酶消化传代用于后续实验。

1.3细胞活性检测 收集对数生长期的FRO细胞，加到96孔培养板中(5 000个/100 μL/孔)；37 ℃、5% CO2培养箱中培养，至细胞长满孔底后吸出培养基，加入终浓度分别为2.5,5,10,20,40,80 μg/mL的去甲斑蝥素培养液继续培养，每个浓度设5个平行孔，分别于培养12 h、24 h、48 h取出培养板，用含10 μL CCK-8溶液的无血清培养基继续培养4 h，酶标仪测定450 nm处每孔的吸光度(OD)值，计算细胞增殖抑制率[(对照孔A-实验孔A)/(对照孔A-空白孔A)×100%]。

1.4细胞划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期FRO细胞，分为空白组(只加培养基)、10 μg/mL去甲斑蝥素组、20 μg/mL去甲斑蝥素组、40 μg/mL去甲斑蝥素组，分组处理后，置于37 ℃、5% CO2箱内培养24 h，胰酶消化各组细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL并接种于6孔板内，每孔加入2 mL,至细胞达80%融合，在6孔板底板部位用灭菌的100 μL Tip头做一字划痕并做标记，洗净脱落细胞及细胞碎片，用无血清培养基继续培养24 h。分别于0 h、12 h和24 h后在倒置显微镜下观察划痕区域细胞的迁移愈合情况并拍照，使用 Image J软件计算细胞的迁移面积，用愈合率代表迁移能力。愈合率(%)=(0 h划痕面积-12 h/24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。

1.5Transwell细胞侵袭实验 Matrigel于4 ℃过夜融化，按Matrigel胶：无血清培养基1∶8的比例进行稀释，取稀释胶100 μL加入小室上室，置于培养箱中聚合凝固[5]。取对数生长期FRO细胞,调整细胞浓度为1×106个/mL并接种于6孔板内，每孔加入2 mL,按1.4的方法进行分组处理，培养24 h后，常规消化后用无血清培养基重悬并调整各组细胞密度为2×106个/mL,取100 μL细胞悬液轻轻加人Transwell小室上室，下室中加入含10%胎牛血清的培养基700 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，弃上室培养基，PBS洗2次，棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定30 min，晾干后用0.1%结晶紫染色30 min，晾干，在光学显微镜下观察并拍照。随机选取5个高倍镜视野/孔，计数穿过小室底膜的细胞数，取平均值。实验重复3次。

1.6流式细胞术细胞周期检测 取对数生长期的FRO细胞,调整细胞浓度为1×106个/mL并接种于6孔板内，每孔加入2 mL,按1.4的方法进行分组处理，培养24 h后，收集细胞，用预冷的PBS漂洗细胞2次，制成单细胞悬液，滴加预冷的无水乙醇，至终浓度为70%，4 ℃固定过夜；固定后的细胞经PBS漂洗2次，加入400 μL PI混匀，避光4 ℃染色30 min，流式细胞仪检测分析细胞周期。实验重复3次。

1.7TUNEL法细胞凋亡检测 取对数生长期的FRO细胞,调整细胞浓度为1×106个/mL并接种于96孔板内，每孔加入200 μL,待细胞贴壁后按1.4的方法进行分组处理，培养24 h后，4%多聚甲醛固定1 h，0.1% TritonX-100处理2 min。按照试剂盒说明书进行细胞凋亡染色，激光共聚焦观察、拍照、分析实验结果。

1.8Western blot法E-cadherin和MMP-9表达检测 取对数生长期的FRO细胞，按1.4的方法进行分组处理，置于37 ℃、5% CO2箱内培养24 h，300 μL预冷的细胞裂解液处理各组细胞1 h，4 ℃下13 000 r/min离心15 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，按每孔50 μg上样进行SDS-PAGE分离蛋白，电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，1%BSA，37 ℃封闭1 h，加入1∶1 000稀释的E-cadherin和MMP-9单克隆抗体，室温振荡6 h，洗膜后荧光二抗避光孵育1 h，洗膜，发光。

2 结 果

2.1不同浓度去甲斑蝥素作用不同时间甲状腺癌FRO细胞增殖抑制率 2.5,5，10，20，40，80 μg/mL的去甲斑蝥素处理FRO细胞12 h、24 h、48 h后， FRO细胞增殖抑制率均逐渐增高，具有剂量时间依赖性，见图1。40 μg/mL的去甲斑蝥素作用24 h后，FRO细胞增殖抑制率为(50.21±4.98)%，达到半数致死率，故后续实验选择10,20,40 μg/mL的去甲斑蝥素干预。

2.2各组甲状腺癌FRO细胞迁移能力比较 去甲斑蝥素各组培养12 h和24 h后划痕愈合率均明显低于空白组，且随去甲斑蝥素浓度增加划痕愈合率逐渐降低，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

图2 空白组和去甲斑蝥素各组甲状腺癌FRO细胞划痕实验愈合率

2.3各组甲状腺癌FRO细胞侵袭能力比较 去甲斑蝥素各组培养24 h后，随去甲斑蝥素浓度增加，穿过Transwell小室的细胞数逐渐减少，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 空白组和去甲斑蝥素各组培养24 h后甲状腺癌FRO细胞穿过Transwell小室的数量

2.4各组甲状腺癌FRO细胞周期比较 去甲斑蝥素各组培养24 h后，随去甲斑蝥素浓度增加，处于G2/M期的细胞比例显著升高，G0/G1期的细胞比例显著降低，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图4及表1。

图4 流式细胞仪检测空白组和去甲斑蝥素各组培养24 h后甲状腺癌FRO细胞周期分布

表1 空白组和去甲斑蝥素各组培养24 h后甲状腺癌FRO细胞周期分布情况

2.5各组甲状腺癌FRO细胞凋亡率比较 去甲斑蝥素各组培养24 h后，随去甲斑蝥素浓度增加，细胞凋亡率逐渐增高，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图5。

图5 空白组和去甲斑蝥素各组培养24 h后甲状腺癌FRO细胞凋亡率

2.6各组甲状腺癌FRO细胞中E-cadherin和MMP-9表达情况比较 去甲斑蝥素各组培养24 h后，随去甲斑蝥素浓度增加，E-cadherin表达量明显上调，MMP-9表达量明显下调，各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图6及图7。

图6 空白组和去甲斑蝥素各组培养24 h后甲状腺癌FRO细胞中E-cadherin和MMP-9表达情况

图7 空白组和去甲斑蝥素各组培养24 h后甲状腺癌FRO细胞中E-cadherin和MMP-9相对表达量比较

3 讨 论

去甲斑蝥素是我国首先研制的人工合成的抗肿瘤药物，不仅可以升高白细胞,还可以提高免疫系统的功能，临床上主要用于消化系统肿瘤的治疗，但其抗肿瘤作用的机制仍不明确[6]。

恶性肿瘤细胞周期和凋亡紊乱而具有永生性，迁移和侵袭能力强，易转移[7]。转移多是恶性肿瘤晚期的共有表现，也是导致患者死亡的主要原因[8]。未分化甲状腺癌是恶性度最高的内分泌系统肿瘤，病死率占甲状腺癌的14.0%～39.0%，中位生存期不足半年，多数患者死于远处转移[9]。因此，在未分化甲状腺癌治疗中抑制肿瘤细胞的转移是待解决的关键问题。本实验结果显示，去甲斑蝥素对FRO细胞生长有明显的抑制作用，并呈时间剂量依赖性；划痕实验和Transwell实验结果显示，去甲斑蝥素能够抑制FRO细胞的迁移和侵袭能力，并呈剂量依赖性；流式细胞术结果显示，去甲斑蝥素使FRO细胞周期阻滞在G2/M期，使进入G1期的细胞减少；TUNEL实验显示去甲斑蝥素可以促进FRO细胞凋亡，并具有剂量依赖性。

肿瘤细胞的迁移和侵袭能力与转移相关蛋白表达密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)是依赖锌和钙来表达催化活性的内源性蛋白酶家族,可以通过水解细胞外基质中的蛋白成分，破坏细胞屏障，在肿瘤细胞侵袭转移中起关键作用[10-11]。其中MMP-9属于被糖化的分子量较大的Ⅳ型胶原酶，与肿瘤细胞的生长、转移密切相关[12-13]。 E-cadherin是一种重要肿瘤侵袭转移抑制基因，主要表达于上皮细胞表面，在维持细胞间黏附、细胞极性及正常组织结构中起到重要作用[14]。目前研究表明，细胞间黏附性降低是恶性肿瘤发生转移的关键步骤，E-cadherin降低且表达于胞浆内，可致细胞间黏附性降低，促进肿瘤细胞转移[15-16]。本实验结果显示，随着去甲斑蝥素浓度增高，MMP-9表达量逐渐降低，E-cadherin表达量逐渐增高。

综上所述，去甲斑蝥素可抑制未分化甲状腺癌细胞FRO的增殖、迁移及侵袭能力，可诱导FRO细胞周期发生G2/M期阻滞，诱导细胞凋亡，其机制可能与上调转移相关蛋白E-cadherin表达、下调MMP-9表达有关，但具体调节机制尚待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。