丛枝菌根真菌和糖醇螯合钙对草莓采后果实硬度和细胞壁酶活性及其关键基因表达的影响

屈 艺，曾 明，2

(1 西南大学园艺园林学院，重庆，400716；2 南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆，400716)

草莓果实色泽鲜艳、果香怡人、风味独特、营养丰富，含有多种对人体健康有益的生物活性物质，如维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、花色苷等，是深受消费者喜爱的小浆果，具有重要的经济价值[1]。但是，草莓果实柔软、表皮娇嫩，在采摘、贮藏、运输、销售过程中极易产生机械损伤，从而引发霉变和腐烂，进而造成经济损失，严重制约草莓产业的发展[2]。因此，保持果实硬度、延长草莓货架寿命是亟待解决的问题。

目前，草莓果实贮藏保鲜技术多种多样，包括使用化学杀菌剂、涂膜、气调贮藏、热处理、紫外线辐射等，虽然有的保鲜技术能有效提高草莓的贮藏期，但存在成本高、技术复杂、对场地环境等因素要求严格等问题[3]。钙是构成细胞壁的重要元素，具有稳固细胞壁、保持果实硬度的功能[4]。大量研究表明，合理施用钙肥不仅能改善果实品质，还能延长果实的贮藏期，维持果实的商品性。普通钙盐在植物体内移动性较差，利用率不高，糖醇螯合钙作为一种螯合态钙，在植物体内移动距离较长，是唯一能在植物韧皮部自由传导的钙，且本身无毒副作用，对植物与人体均无任何损伤，是一种良好的钙肥补充剂[5]，近年来，在草莓[6]、茄子[7]、马铃薯[8]、皮球桃[9]等植物中均有报道。丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)广泛分布于自然界土壤中，是一类重要的土壤微生物，能与约80%的陆生植物形成互惠共生关系[10]，提升植物对养分的吸收能力。已有研究表明，AMF共生可促进植物对钙离子的吸收[11]，但AMF共生下施用糖醇螯合钙是否能提升草莓果实硬度还较少报道。

本试验以AMF的优势菌种摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)为对象，研究了接种或不接种AMF条件下，施用不同浓度糖醇螯合钙溶液对草莓采后果实硬度、细胞壁酶活性变化以及果实软化关键基因表达水平的影响，以期为菌根化草莓苗配合糖醇螯合钙的合理施用浓度提供指导，为延长草莓货架寿命提供另一种思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试宿主植物

“红颜”草莓苗(Fragaria×ananassaDuch.)，购于重庆市渝北区海川草莓基地。

1.1.2 供试菌种与供试钙肥

摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)，登录号BGC XJ08A，购于北京市农林科学院植物营养与资源研究所“中国丛枝菌根真菌种质资源库”(BGC)，菌剂包括基质、孢子、根系和菌丝，活性孢子数量为70～80个/g。供试钙肥为糖醇螯合钙，其浓度经测定为156.03 g/L，购于山东海岱绿洲生物工程有限公司。

1.1.3 基质与容器

供试基质为自配营养土(泥炭土∶珍珠岩∶蛭石= 3∶1∶1，V/V/V)，泥炭土、珍珠岩和蛭石均购于重庆市江北区宏帆路宏帆望海花都。基质理化性质为：pH值7.15，有机质含量27.33 g/kg，全氮0.89 g/kg，全磷0.10 g/kg，全钾0.35 g/kg，碱解氮30.10 mg/kg，速效磷228.64 mg/kg，速效钾1 422.20 mg/kg，总钙13.98 g/kg，水溶性钙97.78 mg/kg，可交换钙2 992.00 mg/kg。基质经0.11 Mpa，121 ℃高压蒸汽灭菌2 h，杀死土著杂菌后摊晾备用。栽培容器为1.5加仑的塑料盆，规格为上内口径20 cm，下内口径16 cm，高度20 cm，栽培容器于0.1%高锰酸钾溶液中浸泡24 h后晾干备用，每盆装灭菌基质约6 L。

1.2 试验方法

试验于2019年12月至2020年5月在西南大学园艺园林学院9号温室进行，环境温度、湿度、光照、水肥按照常规管理。

2019年12月8日挑选长势相对一致的健康草莓苗定植，每盆1株。定植1个月后进行菌剂接种处理，每株接种5 g菌剂，对照以同量灭菌菌剂代替。

接种方法：在根际挖5个小坑，将菌剂分施其中。接种后统一常规水肥管理。3个月后进行浇灌钙肥处理。

在绿果期、白果期和粉果期各浇灌1次糖醇螯合钙溶液，以浇灌蒸馏水作为对照，每盆施用量为200 mL。

采用完全随机区组设计，每个处理18株，每小区6株，共计144株，重复3次。试验设置8个处理，见表1。

表1 试验处理

1.3 样品采集及测定指标

2020年5月21日采集果实，选择九成熟、大小均匀、无机械损伤和微生物侵染的草莓果实用于采后贮藏试验。将不同处理草莓果实分装塑料盒中，每处理15个果实，贮藏在温度(4±1) ℃，相对湿度50%～60%保持恒定的冷库中，每4 d取样1次，试验至第12 d结束。

硬度采用GY-4-J型硬度计测定，每组测定5个果实，于果实赤道相对两侧各测定1次，重复测定3次，取其平均值，单位为kg/cm2。

采用DNS比色法测定多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性[12]，采用Zhou等[13]、Verma等[14]的方法稍作修改测定果胶甲酯酶(PME)活性，采用Langer等[15]的方法稍作修改测定β-半乳糖苷酶(β-Gal)的活性。

采用UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(UNlQ-10 Column Trizol Total RNA Isolation Kit)提取草莓果实总RNA。定量PCR试剂为2X SG Fast qPCR Master Mix (High Rox，B639273，BBI，ABI)，定量PCR仪为StepOne Plus型荧光定量PCR仪 (ABI，Foster，CA，USA)。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 26.0软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 硬度

试验结果可以看出，与对照相比，单独施用0.15%或0.20%的糖醇螯合钙溶液或接种AMF联合施用糖醇螯合钙溶液均能显著提升果实的硬度并延缓果实软化。其中，F3(接种AMF联合施用0.20%糖醇螯合钙)处理效果最佳，相较于N0、F0、N3处理，草莓果实硬度分别提升了7.0%、7.1%、2.4%，说明接种AMF并施用0.20%糖醇螯合钙溶液效果好于单独施钙处理和单独接种处理，且糖醇螯合钙浓度以0.20%的效果最佳(见图1)。

从图1中可以看出，随着贮藏时间的不断延长，草莓果实硬度呈不断下降趋势。在贮藏过程中，各处理的果实硬度均高于N0对照组，表明单独施钙处理和接种联合施钙处理均能延缓草莓果实的软化。就减缓果实软化的程度而言，单独施钙处理不如接种与施钙结合处理的效果好。就糖醇螯合钙施用浓度而言，单独施钙处理中，浓度为0.1%与0.15%之间差异不显著；在接种与施钙联合的处理中，随着糖醇螯合钙浓度的增加，对果实硬度的增加作用和对果实软化的延缓作用逐渐增强。至试验结束时(采后第12 d)，N1、N2、 N3、F1、F2、F3处理的果实硬度较处理前分别下降了6.8%、9.4%、5.9%、3.1%、2.6%、2.2%，而对照组N0、F0的果实硬度分别下降了10.5%、10.2%，说明单独施用糖醇螯合钙、接种AMF并施用糖醇螯合钙均能在贮藏期间有效保持草莓果实的硬度，延缓果实的软化，延长货架期，其中以接种AMF联合施用0.20%糖醇螯合钙溶液效果最好。

注：处理N0—N3，F0—F3详见表1。图2至图6同。

2.2 细胞壁酶活性

试验结果看出，贮藏期间草莓果实的PG、PME、β-Gal活性逐渐上升，在第12 d时各类酶活性达到最大，PG、PME活性在第12 d时上升较快。经0.15%、0.20%糖醇螯合钙单独处理或钙与AMF联合处理的PG、PME、β-Gal活性均低于对照组。在试验结束时，F3处理组的PG、PME、β-Gal活性分别是N0对照组的58.14%、70.07%、82.24%。结果表明，随着贮藏时间的增加，特别是在贮藏第12 d，单独施用0.15%或0.20%的糖醇螯合钙、接种AMF并施用糖醇螯合钙均抑制了PG、PME、β-Gal活性的上升，AMF和糖醇螯合钙复合处理的抑制效果优于单独钙处理，其中以0.20%的糖醇螯合钙联合AMF处理效果最明显(见图2至图4)。

图2 AMF和糖醇螯合钙对“红颜”草莓细胞壁多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的影响

图3 AMF和糖醇螯合钙对“红颜”草莓细胞壁果胶甲酯酶(PME)活性的影响

图4 AMF和糖醇螯合钙对“红颜”草莓细胞壁β-半乳糖苷酶(β-Gal)活性的影响

2.3 关键基因相对表达量

2.3.1 总RNA的提取

图5为草莓果实贮藏第12 d时总RNA的电泳检测结果，条带明亮、清晰，完整性较好。

注：Marker为DNA Marker，其只为检测基因组污染，并不代表RNA条带大小。

2.3.2FaPG1、FaβGal4基因表达

至试验结束(采后贮藏第12 d)，与对照组N0相比，试验组的FaPG1、FaβGal4基因表达量均得到了一定的抑制。未接种AMF条件下，施用0.15%、0.20%糖醇螯合钙的FaPG1、FaβGal4基因表达量显著降低。N2处理(单独施用0.15%糖醇螯合钙)的FaPG1、FaβGal4基因表达量分别比对照组N0降低39.72%、35.91%；N3处理(单独施用0.20%糖醇螯合钙)分别比对照组N0降低47.67%、50.20%。接种AMF条件下，随着糖醇螯合钙浓度的升高，对FaPG1、FaβGal4基因表达的抑制作用逐渐增强，其中，0.20%的糖醇螯合钙联合AMF处理的FaPG1、FaβGal4基因表达量分别比对照组F0降低58.67%、59.77%；比N3处理降低21.02%、19.21%。相较于对FaβGal4基因表达的抑制作用，AMF与糖醇螯合钙的联合作用对FaPG1基因表达的抑制作用更强(见图6)。

图6 AMF和糖醇螯合钙对“红颜”草莓FaPG1、FaβGal4基因表达的影响

3 结论与讨论

本试验发现，不接种AMF时，单独施用0.10%浓度的糖醇螯合钙对草莓果实的硬度没有显著影响，同样地，对多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)的活性也没有显著影响。0.15%、0.20%的糖醇螯合钙可以增加果实硬度，延长贮期。在接种AMF条件下，对软化和细胞壁酶活性的抑制情况表现为随着糖醇螯合钙浓度的升高，抑制作用越明显。

细胞壁的成分由一系列细胞壁修饰酶催化，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲酯酶(PME)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和纤维素酶(Cx)等降解酶[16]。其中PG是果实软化中最典型、最重要的酶之一，其作用于果胶分子，促使果胶降解、细胞壁解体，进而导致果实软化。PME则和PG发生协同作用，催化果胶酯酸转化为果胶酸，去酯化的果胶从而作为PG水解的底物[17]。β-Gal降解或溶解成熟果实细胞壁中的多糖，使细胞壁组分变得不稳定，从而使细胞膨胀并发生软化[18]。这些酶作为果实软化研究中的热点被广泛关注，在多种水果中均有报道，如桃、葡萄、梨、苹果、番茄、草莓等。糖醇螯合钙作为一种新型钙剂，能有效抑制细胞壁酶活性。裴健翔[19]以“寒富”苹果为供试品种，在果实不同成熟时期喷施糖醇螯合钙，发现与其他钙剂相比，糖醇螯合钙能显著抑制细胞壁酶活性上升。本试验以“红颜”草莓为试材，设置了12 d的贮藏期限，每4 d观察记录一次，分阶段观察了草莓果实贮藏期间细胞壁酶活性的变化情况。结果表明，单独施用0.15%、0.20%的糖醇螯合钙或AMF配施糖醇螯合钙均能达到抑制细胞壁酶活性的目的，从而延缓果实软化，维持果实硬度，延长草莓货架期，且联合施用比单独施钙更有效。

为了进一步了解“红颜”草莓果实的软化，本试验探究了果实软化关键基因FaPG1、FaβGa4l的表达情况。试验发现，贮藏期结束时，与对照相比，各处理草莓果实的两种基因的表达均得到了抑制。PG作为影响细胞壁结构的众多酶中最重要的酶之一，其基因表达与草莓果实的软化过程关系密切。Garcia-Cago[20]等人通过对草莓中的FaPG1和FaPG2进行沉默，研究表明，FaPG1在草莓软化过程中的细胞壁结构变化中起着至关重要的作用。在本次试验中，FaPG1、FaβGa4l基因的表达趋势分别与PG、β-Gal活性的变化一致，0.15%、0.20%糖醇螯合钙的单独施用或AMF配施糖醇螯合钙有效抑制了FaPG1、FaβGa4l基因的表达，保持了草莓果实的硬度，依旧是AMF联合施钙比单独施钙更有效。本试验仅重点关注了2个细胞壁酶活性相关基因的表达量，与细胞壁酶活性相关的其他基因的表达情况还需进一步探究。

综上所述，接种AMF联合施用糖醇螯合钙能维持“红颜”草莓采后果实硬度，抑制PG、PME、β-Gal活性，延缓软化进程，延长贮期。糖醇螯合钙与AMF配施的最佳浓度为0.20%。