抗精神病药喹硫平对少突胶质细胞周期的影响及其作用机制研究*

王斓，陈浙丽，徐亮，徐小明，王轶虎

（湖州市第三人民医院 老年精神科，浙江 湖州313000）

1 材料与方法

1.1 细胞及实验动物

1.1.1 少突胶质细胞的来源及培养少突胶质细胞从新生的Sprague-Dawley 大鼠大脑皮层组织中制备[9]，其原代培养是基于McCarthy 技术[10]。实验前，将OPCs 接种于增殖培养基中培养48 h。增殖培养基为DMEM/F12，并添加2%B27、0.5%胎牛血清、L-谷氨酰胺、抗生素、血小板源性生长因子（plateletderived growth factor, PDGF）10 ng/ml 和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）10 ng/ml。

1.1.2 实验动物雄性CD-1 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0013]，12 h 昼/夜循环照明。12 只小鼠随机分为对照组和喹硫平组，每组6 只。分别给予生理盐水和富马酸喹硫平10 mg/（kg·d）盐水溶解后腹腔注射30 d。最后一次注射12 h 后处死小鼠，解剖前额皮质进行基因表达分析。

1.2 主要仪器、试剂及药物

1.2.1 主要仪器流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司），ViiA 7 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）系统（美国应用生物系统公司）。

1.2.2 主要试剂与药物B27（美国Thermo Fisher Scientific 公司），PDGF 和bFGF（美国Protech 公司），大鼠单克隆anti-溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine,BrdU）和p21（英国Abcam 公司），兔多克隆anti-Ki67和p21 shRNA 质粒（美国Santa Cruz 公司），1% N2 和β-actin（英国Sigma 公司），Trizol 试剂（美国Invitrogen公司），Trizol 试剂盒（美国Invitrogen 公司）。富马酸喹硫平（英国AstraZeneca UK Limited 公司，批准文号：H20160665，规格：0.2g×20 片）

1.3 细胞周期检测

将OPCs 细胞按5×105个细胞/孔接种于聚-赖氨酸包覆的6 孔板中。在增殖培养基中培养48 h，用碱性培养基（含2%B27 的DMEM/F12 培养基）替代培养，并用喹硫平（1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）处理48 h。为检测喹硫平对PDGF 诱导的细胞周期激活的影响，增殖培养基培养48 h 后，用基础培养基替代培养基，并加入PDGF（10 ng/ml）、喹硫平（10 μmol/L）或两者的混合物培养48 h。将OPCs 细胞分为对照组（培养48 h）、PDGF 组（加入PDGF 10 ng/ml 培养48 h）、喹硫平组（加入喹硫平10 μmol/L培养48 h）和PDGF+喹硫平组（加入PDGF 10 ng/ml和喹硫平10 μmol/L，培养48 h）。OPCs 用0.25%胰蛋白酶消化，70%乙醇固定，采用流式细胞术测定细胞周期中G0/G1、S、G2 期细胞百分比[11]，使用Cell Quest Pro 软件对数据进行分析。

1.4 细胞周期退出指数测定

OPCs 细胞可以在细胞周期中继续循环自我更新，也可以退出细胞周期进行分化。细胞周期退出是少突胶质细胞分化的前提条件，因此本实验检测喹硫平和PDGF 对细胞周期退出的影响。细胞周期分为静息期（G0）、准备期（G1）、DNA 复制期（S）、S 和M 期之间的间隙（G2）和细胞分裂期（M）。采用BrdU 抗体标记处于S 期的细胞，使用Ki-67 抗体标记除G0 期外整个细胞周期的增殖细胞，计算细胞周期退出指数。BrdU+/Ki-67+双标记细胞表示细胞周期内的细胞比例，BrdU+/Ki-67 细胞表示细胞周期外的细胞比例。细胞周期退出指数以BrdU+/Ki-67-细胞数除以BrdU+细胞总数表示[12]。将OPCs细胞接种在24 孔板上，增殖培养48 h。用基础培养基（含2% B27 的DMEM/F12 培养基）替代培养，加入PDGF 10 ng/ml、喹硫平10 μmol/L 或两者的混合物培养24 h，并分为对照组（培养24 h）、PDGF 组（加入PDGF 10 ng/ml 培养24 h）、喹硫平组（加入喹硫平10 μmol/L 培养24 h）和PDGF+喹硫平组（加入PDGF 10 ng/ml 和喹硫平10 μmol/L 培养24 h）。固定OPCs细胞，细胞核DNA 变性后，用大鼠单克隆anti-BrdU（1∶100）和兔多克隆anti-Ki67 一级抗体（1∶100）孵育，用结合荧光染料的二级抗体进行免疫细胞化学检测。

1.5 细胞分化分析

将OPCs 细胞按2.5×104个细胞/孔接种于24 孔板中，增殖培养48 h。将增殖培养基替换为分化培养基，并在培养基中加入喹硫平后持续培养3 d。将OPCs 细胞分为对照组（培养3 d）、喹硫平10 μmol/L组（加入喹硫平10 μ mol/L 培养3 d）和喹硫平20 μmol/L 组（加入喹硫平20 μmol/L 培养3 d）。少突胶质细胞分化培养基为DMEM/F12，并添加1%N2、L-谷氨酰胺、0.5%胎牛血清、抗生素、三碘甲状腺氨酸9.8 g/L、生物素10 g/L 和转铁蛋白25 g/L。使用抗体髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）（成熟少突胶质细胞的标志）对细胞培养物进行免疫细胞化学检测。使用激光扫描共聚焦显微镜获取图像，Image-Pro Plus 软件进行分析。在分化培养基中加入喹硫平后3 d 和4 d，采用少突胶质细胞标志物MBP 固定并标记少突胶质细胞，根据形态复杂性将MBP 阳性细胞分为低分化和高分化。

1.6 qRT-PCR

小鼠前额皮质区域表现出最明显的髓鞘特异性基因表达变化。为研究喹硫平对细胞周期的调控机制，本研究测定喹硫平干预（10 mg/kg，1 次/d）小鼠30 d 后，小鼠前额皮质中8 个细胞周期相关mRNA 相对表达量。其中包括细胞周期蛋白D1（Ccnd1）、细胞周期依赖激酶2（CDK2）、CDK4、转录因子2（E2F2）和视网膜母细胞瘤蛋白1（Rb1），其可正向调节细胞周期G1/S、G2/M 转变、DNA 合成和有丝分裂。另外检测环独立激酶抑制剂p21 和p27 的相对表达量，以及p21 的上游介质转录因子p53 的相对表达量。按照Trizol 试剂盒说明书进行操作提取总RNA。利用SuperScriptTMⅢ逆转录酶将总RNA 1.5 μg 合成cDNA。通过ViiA 7 qRT-PCR 系统进行qRT-PCR 反应，引物序列见表1。PCR 反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共计40 个循环。β-actin 为mRNA 表达的内参，每个样本检测3 次，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

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表1 qRT-PCR引物序列

1.7 Western blotting

将Vector shRNA或p21 shRNA转染OPCs细胞6 h，然后在分化培养基中培养3 d。转染后第4 天，用冷PBS 洗涤少突胶质细胞，然后在NP-40 裂解缓冲液中裂解。4℃、12 000 r/min 离心10 min，裂解液通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。用5%牛奶封膜，并用p21（1∶200）或β-actin 的一抗检测，用相应的二抗孵育膜。使用增强化学发光检测试剂盒对膜进行可视化检测。

1.8 shRNA转染

为确定p21 在少突胶质细胞周期调控中的作用，本实验采用shRNA 介导敲低p21 的表达。用p21 shRNA 或空载体进行Western blotting 检测以确定转染效率。p21 shRNA 质粒由3 个靶向特异性载体质粒组成。实验前，将OPCs 细胞在增殖培养基中保存48 h。然后将增殖培养基替换为转染培养基。将共1 μg p21 shRNA 或1 μg 对照shRNA 和转染试剂添加到培养基中。根据细胞转染情况将细胞分为对照组（正常培养），空载体组（将1 μg 对照shRNA 转染到细胞系中），p21 shRNA 组（将1 μg p21 shRNA 转染到细胞系中），OPCs 孵育6 h。增殖实验中，转染6 h 后用增殖培养基替换原培养基，加入BrdU 10 μg/ml 孵育12 h。在分化实验中，转染6 h 后将培养基换成含有1 μg/ml 嘌呤霉素抗生素的分化培养基，以杀死未转染的细胞。第4 天，对OPCs 细胞进行Western blotting、细胞周期分布和免疫细胞化学检测。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism version 7.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用Bonferroni 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喹硫平对PDGF 促进细胞有丝分裂有抑制作用

对照组、PDGF 组、喹硫平组和PDGF+喹硫平组的G0/G1 期、S 期和G2 期细胞百分比比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较：与对照组比较，PDGF 组G0/G1 期细胞百分比低（P<0.05），S 期和G2 期细胞百分比高（P<0.05），说明PDGF 促进细胞有丝分裂；与PDGF 组比较，PDGF+喹硫平组G0/G1 期细胞百分比高（P<0.05），S 期和G2 期细胞百分比低（P<0.05），说明喹硫平对PDGF 促进细胞有丝分裂有抑制作用。见表2。

表2 喹硫平抑制PDGF促进细胞有丝分裂作用 （%，x±s）

2.2 喹硫平促进细胞周期退出并阻断PDGF 的作用

对照组、PDGF 组、喹硫平组和PDGF+喹硫平组的细胞周期退出指数分别为（0.11±0.02）、（0.06±0.01）、（0.15±0.02）和（0.11±0.01），经方差分析，差异有统计学意义（F=8.944，P=0.000）。进一步两两比较：与对照组比较，PDGF 组细胞周期退出指数低（P<0.05），喹硫平组细胞周期退出指数高（P<0.05），说明PDGF 抑制细胞周期退出，喹硫平促进细胞周期退出；与PDGF 组比较，PDGF+喹硫平组细胞周期退出指数高（P<0.05），说明喹硫平阻断PDGF 对细胞周期退出的影响。

2.3 喹硫平促进OPCs细胞分化

在高分化细胞中，对照组、喹硫平10 μmol/L组和喹硫平20 μmol/L 组高分化和低分化细胞数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较：与对照组比较，喹硫平10 μmol/L 组和喹硫平20 μmol/L 组高分化细胞数高（P<0.05），低分化细胞数量低（P<0.05），表明喹硫平可提高OPCs 细胞的成熟率，降低低分化细胞数。见表3。

表3 喹硫平促进OPCs细胞分化 （%，±s）

表3 喹硫平促进OPCs细胞分化 （%，±s）

注：†与对照组比较，P<0.05。

组别低分化细胞高分化细胞对照组喹硫平10 μmol/L组喹硫平20 μmol/L组F 值P 值63.12±5.47 42.06±4.32†21.07±3.04†21.249 0.000 10.05±1.02 30.13±2.37†50.00±5.15†22.054 0.000

2.4 喹硫平上调p21 mRNA的表达

两组p21 mRNA 相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05），喹硫平组高于对照组，表明喹硫平干预后p21 表达升高；而其他mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 两组mRNA相对表达量比较 （±s）

表4 两组mRNA相对表达量比较 （±s）

注：†与对照组比较，P<0.05。

组别Rb1 mRNA cdk2 mRNA Cdk4 mRNA P27 mRNA Ccnd1 mRNA P53 mRNA P21 mRNA E2f2 mRNA对照组喹硫平组t 值P 值0.38±0.03 0.41±0.05 1.627 0.121 0.02±0.01 0.03±0.01 1.412 0.171 0.08±0.03 0.07±0.01 1.000 0.331 0.04±0.02 0.03±0.01 1.414 0.174 0.03±0.01 0.04±0.02 1.414 0.174 0.07±0.02 0.08±0.03 0.877 0.392 0.51±0.03 1.15±0.05†34.709 0.000 0.03±0.01 0.05±0.03 2.000 0.061

2.5 下调p21对OPCs细胞周期分布的影响

对照组、空载体组和p21 shRNA 组p21 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较：与对照组和空载体组比较，p21 shRNA 组p21 蛋白相对表达量低（P<0.05）。见表5 和见图1。

图1 各组p21蛋白的表达

对照组、空载体组、p21 shRNA 组S 期和G2 期细胞百分比比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较：与空载体组和对照组相比，p21 shRNA 组S 期细胞百分比高（P<0.05），G2 期细胞百分比低（P<0.05），表明下调p21 可增加S 期细胞百分比，降低G2 期细胞百分比。见表5。

表5 各组p21蛋白相对表达量和细胞周期比较 （±s）

表5 各组p21蛋白相对表达量和细胞周期比较 （±s）

注：†与p21 shRNA组比较，P<0.05。

组别G2期/%p21蛋白S期/%对照组空载体组p21 shRNA组F 值P 值3.02±0.21†2.85±0.24†1.13±1.13 5.206 0.000 0.38±0.05†0.36±0.03†0.21±0.02 9.983 0.000 7.05±0.72†8.00±0.85†13.12±1.08 14.788 0.000

2.6 下调p21对少突胶质细胞增殖的影响

对照组、空载体组和p21 shRNA 组的BrdU 阳性细胞率分别为（30.12±3.05）%、（33.21±4.17）%和（44.25±3.68）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=5.469，P=0.000）。进一步两两比较：p21 shRNA 组BrdU 阳性细胞率高于对照组和空载体组（P<0.05），表明下调p21 可增加BrdU 阳性细胞，促进少突胶质细胞增殖。

2.7 下调p21对少突胶质细胞分化的影响

对照组、空载体组和p21 shRNA 组MBP 阳性细胞率分别为（39.24±4.07）% 、（32.19±3.33）% 和（18.54±2.28）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=9.762，P=0.000）。进一步两两比较：p21 shRNA组MBP 阳性细胞率低于对照组和空载体组（P<0.05），表明下调p21 可降低MBP 阳性细胞，抑制少突胶质细胞分化。

3 讨论

精神分裂症是一种临床上常见的慢性、致残性精神疾病，主要特征表现为情感、思维、行为、意志障碍等[13]。精神分裂症具有发病率高、致残率高、治愈率低等特点，给临床治疗和护理造成巨大的压力，同时也给社会和患者家庭带来沉重的经济负担[14]。目前，普遍认为精神分裂症是由遗传和环境因素相互作用所致，但其发病机制仍尚未完全了解。本研究通过探讨非典型抗精神病药物奎硫平在体内外对少突胶质细胞周期调节的影响，发现喹硫平可以促进细胞周期的退出，加速少突胶质细胞的分化，另外，喹硫平治疗可使小鼠前额皮质p21 mRNA 显著升高，下调p21 的表达增强细胞的增殖和延迟分化。

据报道，在精神分裂症患者中，CyclinD1、D2、E 和Cyclin A2 等细胞周期阳性调节因子的mRNA 相对表达量明显上调，而周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27 mRNA 和p57 mRNA 相对表达量显著下调[15]。另有研究表明，暴露在草酸双下的小鼠少突胶质细胞周期调节因子（包括Cyclin A2、CyclinD1 和CyclinF）的表达水平明显上调[16]。由此可见，细胞周期基因表达的异常可能是精神分裂症和铜中毒小鼠少突胶质细胞缺失的原因之一。此外，经过草酸双干预的小鼠表现出较高水平的标记为NG2 和血小板衍生的生长因子α 的OPCs，以及成熟少突胶质细胞数的明显减少[17-18]。而在草酸双诱导的去髓细胞模型中，OPCs 细胞为何不能进一步分化为成熟少突胶质细胞尚不清楚。生长因子的异常分泌和细胞周期的激活似乎是阻碍OPCs 细胞分化的重要机制。PDGF 和bFGF 可促进OPCs 增殖，抑制其分化[19]。FGF2 甚 至可以刺激有丝分裂后少突胶质细胞重新进入细胞周期的S 期[20]。细胞周期的激活可使OPCs 处于增殖状态，导致OPCs 分化的缺失，此外，细胞周期退出失败可导致少突胶质细胞凋亡，阻碍少突胶质细胞分化[21]。有研究指出，抑制PDGF 受体信号可以促进少突胶质细胞分化[22]。本研究发现，PDGF 可防止OPCs 从细胞周期中退出（抑制细胞周期退出），增加S 期和G2 期细胞数。10 μmol/L 喹硫平可刺激OPCs细胞周期退出，抑制PDGF 诱导的细胞周期激活。由于细胞周期退出是细胞分化的前提条件，喹硫平可通过调节少突胶质细胞的细胞周期进程，促进少突胶质细胞分化，减轻髓鞘脱髓。

p21 是一种细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，能够影响所有的细胞周期蛋白复合物[23]。p21 与细胞周期退出增加有关，而下调p21 可导致少突胶质细胞周期退出减少[24]。与此相反，p21 还可以作为一种正向的细胞周期调节剂，通过促进活性周期蛋白D1/CDK4 复合物，刺激少突胶质细胞的S期进入细胞周期[25]。本实验使用shRNA 敲低p21 的表达，观察到OPCs 增殖数量明显增加（BrdU+标记）和成熟少突胶质细胞数量显著减少（MBP 标记）。可见p21 作为细胞周期的负调控因子，可能有利于奎硫平促进OPCs 细胞分化的作用。

既往研究表明，非典型抗精神病药物奥氮平可通过阻滞胶质瘤干细胞（GSCs）周期，抑制其增殖并诱导其向少突胶质细胞分化[26]。此外，喹硫平还能通过促进GSCs 向少突胶质细胞分化，有效抑制GSCs 启动的肿瘤生长，发挥抗胶质瘤的作用[27]。由此可见，抗精神病药物喹硫平可能是临床治疗脱髓鞘疾病和恶性胶质瘤的一种有效药物。虽然抗精神病药物喹硫平在体外能够有效调节少突胶质细胞的细胞周期进程，促进少突胶质细胞分化，减轻髓鞘脱髓，但是在体内能否对p21 起到有效的调节作用，仍需要进一步的验证。综上所述，喹硫平可能通过调节少突胶质细胞的细胞周期来调节少突胶质细胞的分化。