母猪上呼吸道感染金黄色葡萄球菌的分离鉴定

赵 健，韩志金，陈爱军，那仁满都呼

(1. 内蒙古农业大学科技园区管理办公室，内蒙古 呼和浩特100018；2. 内蒙古农业大学职业技术学院；3. 内蒙古和林格尔县高级职业中学)

在养猪场中，由于环境卫生差，常常发生猪葡萄球菌病。近年来，该病已成为限制养猪业快速发展的主要传染病之一。引起猪葡萄球菌病的病原属于微球菌科(M icro coccaceae)葡萄球菌属(Staphy lococcus)的猪葡萄球菌与金黄色葡萄球菌等(Staphy lococcus aureus)。分类上属于革兰氏阳性菌，是一类最为常见的条件致病微生物。

由于各地流行的菌株不同，往往给猪葡萄球菌病的预防和治疗带来很多困难。同时，葡萄球菌易产生耐药性，导致耐药菌株不断产生，致使该病治疗效果下降，给养猪业造成严重的经济损失。此外，据报道与感染猪群接触的人也可出现菌血症、败血症和多器官功能衰竭。

2018年5月，内蒙古呼和浩特市郊区某猪场发生了一种以母猪流鼻涕继而咳嗽气喘，先后用氟苯尼考、替米考星、卡那霉素、土霉素、强力霉素、林可霉素、安乃近等一种或两种联合肌肉注射、饲料给药，治疗效果不理想。后经病原分离鉴定为金黄色葡萄球菌。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

自制血琼脂平板(含5%绵羊红细胞)；培养基与微量生化管购自海博生物技术有限公司；革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；抗生素纸片购自杭州滨河微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒与胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；PCR扩增试剂及引物购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器设备

显微镜，日本OLYMPUS；PCR仪，美国基因公司；高速冷冻离心机，德国赛多利斯公司；水平电泳仪，北京百晶生物科技有限公司；凝胶成像系统，美国BioRad公司。

1.3 方法

1.3.1 病料采集 病料采自呼和浩特郊区某发病猪场流鼻涕的母猪。从母猪鼻腔用无菌注射器吸取粘液15份(样品1)、无菌采集鼻拭子15份(样品2)、鼻镜靠鼻孔处棉签擦取物15份(样品3)。

1.3.2 病原分离 将上述病料分别划线于普通琼脂平板和血琼脂平板，37℃倒置培养18～24 h，挑取典型菌落接种于营养肉汤液体培养基，在37℃下培养12 h后，进行革兰氏染色和显微镜检查。

1.3.3 生化鉴定 取上述菌液分别进行糖发酵试验、尿素酶试验、硝酸盐还原实验、V-P试验、血浆凝固酶试验。

1.3.4 细菌PCR 扩增鉴定 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组。根据GenBank上公布的S. aureus Sip基因序列，利用primer 5.0设计引物，以提取的细菌基因组DNA为模板，进行PCR 扩增；阴性对照物以纯水代替细菌基因组DNA。

表1 PCR扩增引物序列

25 μL反应体系：dNTPs 2.0 μL、PCR 10×buffer 2.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O 16 μL、上下游引物各0.5 μL、模板3 μL。

扩增条件：94℃预变性5 min；95℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，32个循环后；72℃延伸10 min，4℃条件下保存。回收和纯化PCR产物片段后，送往上海生工生物工程有限公司测序。测序结果采用BLAST进行序列同源性分析。

1.3.5 药敏试验 选取样品1采用纸片扩散法进行药敏试验。具体做法：取100μL的菌液用涂布棒均匀涂布于营养琼脂培养基上，用灭菌镊子将药敏纸片平放在板上，置于37℃培养箱中培养18～24 h后，测量并记录分离菌株的抑菌圈直径。分析判定标准依据2010版美国丹麦临床标准委员会(NC-CLS)手册。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养及其生化特性

由图1和表2可见，分离菌在普通营养琼脂培养基上和5%血琼脂平板培养基上生长良好。普通琼脂平板上菌落表面光滑、隆起、边缘整齐，菌落较小。血琼脂平板上菌落周围有β溶血现象。菌落涂片和革兰氏染色镜检结果表明，该细菌为革兰氏阳性菌。菌体形态为球形、成对、短链状、葡萄串状。分离株能够以大多数糖类为底物进行发酵。尿素酶发酵试验显示为阳性，V-P 试验、硝酸盐还原酶以及醇类(甘露醇)发酵试验均呈阴性，血浆凝固酶试验呈阳性。根据以上形态及其生化特性，初步判断分离菌可能是葡萄球菌。

图1 分离菌的革兰氏染色镜检结果(×100)

表2 分离菌的生化反应结果

2.2 PCR鉴定结果

以提取的细菌基因组DNA为模板，分别以Sip-F、Sip-F和16s-F、16s-R为引物进行基因扩增，将PCR产物上样1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳检测，分别在1249 bp、1500 bp处出现明显条带。

图2 16S rRNA通用引物扩增基因电泳图

图3 特异性引物扩增基因电泳图

样品DNA测序结果通过NCBI网站Blast序列比对，测序结果表明，样品基因序列与金黄色葡萄球菌参考株序列的同源性为99%。

图4 样品1基因序列对比结果

图5 样品2 基因序列对比结果

图6 样品3 基因序列对比结果

2.4 药敏试验结果

药敏试验结果显示该菌株对拜有利高度敏感，对庆大霉素、头孢噻污、氧氟沙星、卡那霉素、氯霉素中度敏感，对林可霉素、四环素等耐药(见表3)。

表3 菌株的药敏实验结果

3 分析与讨论

本试验是对内蒙古呼和浩特市郊区，某猪场母猪发生的一种以流青白色粘稠鼻涕、继而咳嗽气喘为主要临床特征的疾病进行研究。应用细菌培养、生化鉴定、药敏试验和核苷酸序列测定分析，发现所分离的菌株为金黄色葡萄球菌。一般来说，金黄色葡萄球菌是最为常见的条件致病微生物，病原体存在与于健康动物的皮肤和呼吸道等部位。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原，其极易产生耐药性，治疗相当困难。在这次母猪感染中，运用多种抗生素和长时间的治疗都起不到预期的效果。因此，我们在金黄色葡萄球菌病的治疗过程中是否考虑运用中草药制剂，需要做进一步研究。陈希文等研究发现川牛膝、黄芩、茯苓、地榆、虎杖等中药多糖对猪源金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性最强。葡萄球菌是条件致病菌，正常情况下是猪舍环境中、猪体表、呼吸道常在菌。

金黄色葡萄球菌与猪葡萄球菌在形态和致病性等特征具有很高的相似性，核苷酸序列高度同源。因此，多数诊断为猪葡萄球菌感染的病例可能存在金黄色葡萄球菌，临床上应予以重视。

本研究通过采集的样品进行了菌株分离培养，生化试验、药敏试验和菌株DNA序列测定，确定了引起猪鼻炎和呼吸道症状为特征的疾病病原金黄色葡萄球菌。研究结果可为本病的诊断和防治奠定基础。有关该分离菌的毒力因子分析以及接种健康猪致病试验还需进一步研究。