新辅助化疗对大肠腺癌组织中的CXCL6、CXCL16表达的影响及其临床意义

王丽华 李成

大肠癌为消化系统最常见癌症之一,为全世界第三大常见恶性肿瘤,随着环境污染加重,人们的饮食习惯改变,生活节奏的加快等等因素的影响,大肠癌发病率不断地提高［1］。目前传统的手术方式已经不能满足患者的需求,尤其对于中晚期大肠腺的患者来说,新辅助化疗无疑给患者带来希望和福音［2］。因此新辅助化疗的疗效检测就显得尤其重要。炎症性趋化因子CXCL6 和CXCL16 可能会很好的反映出化疗效果。据报道CXCL6/CXCL16 参与炎症细胞的趋化,激发淋巴细胞、NK/T 细胞等,调节免疫应答［3］。新辅助化疗后的癌组织及癌周组织微环境的改变提示新辅助化疗的疗效可能与CXCL6/CXCL16 有关,也预示着CXCL6/CXCL16 可能成为癌症的免疫治疗的新的靶向位点。

1 材料与方法

1.1 材料 收集本院2014～2015 年患者术前经过辅助化疗、术后有完整病理的病例98 例,均为大肠腺癌中分化,Duke 分期均在Ⅲ期,患者平均年龄65.5 岁,男女比例为1.2∶1。收集2018～2019 年本院经过新辅助化疗大肠腺癌新鲜标本30 例,5 例未经过新辅助化疗的大肠腺癌新鲜组织作为对照组。患者平均年龄63.7 岁,男女比例为1.1∶1。所有经过新辅助化疗的患者均接受术前化疗(替加氟注射液1 g,q.d.；亚叶酸钙注射液0.2 g,q.d.；注射用盐酸昂丹司琼8 mg,q.d.),新辅助化疗治疗2～3 周后行大肠癌根治切除术。

1.2 抗体及试剂 兔抗CXCL6多克隆抗体(PA5-67571,美国赛默飞公司),工作浓度1∶100。兔抗CXCL16 多克隆抗体(ab101404,Abcam 公司),工作浓度1∶200。辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗以及二氨基联苯氨(DAB)显色剂均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。电化学发光(ECL)试剂盒购于上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色 用4%甲醛分别固定肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织,常规脱水后进行石蜡包埋,切片,脱蜡,柠檬酸钠溶液中进行抗原修复,分别加入稀释后的CXCL6 一抗、CXCL16 一抗,以PBS 代替一抗作为阴性对照,4℃过夜孵育,加入稀释后的HRP 标记的二抗,DAB 溶液显色镜下观察阳性反应。染色结果进行评分。评分标准：癌细胞及癌周淋巴细胞免疫组化的评分标准用H-score 系统［4］：H-score=［1×(%cell 1+)+2×(%cell 2+)+3×(%cell 3+)］。阳性细胞百分比分级标准：得分在0～49 分为0 级,得分在50～99 分为1 级,等分在100～199 分为2 级,得分在200～300 分为3 级。其中1+为细胞浆内黄色着色；2+为细胞浆内棕黄色着色；3+为细胞浆内棕褐色,粗颗粒状着色。阳性着色细胞数：400 倍视野下每张玻片随机选取5 个视野,计数至少200 个细胞,观察每个视野中阳性细胞表达率=阳性细胞计数/细胞总数×100%,并取均值。

1.3.2 Western blot 分别取约1 g 新辅助化疗大肠腺癌新鲜标本及对照组织加入蛋白裂解液裂解后,以10 µg/10 µl 上样量在到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳；采用湿式电转印将蛋白转印到PVDF 膜上,转膜条件为4℃,恒压90 V,120 min；随后在5%脱脂奶粉或者牛血清白蛋白(BSA)溶液中室温封闭1 h；加入相应的一抗在4℃下孵育过夜,TBST 将膜浸洗3 次,加入二抗室温震荡孵育1 h；TBST 浸洗3 次,5 min/次。浸洗后将膜放于发光板上,添加ECL 发光,利用化学发光成像系统结合相关软件检测蛋白变化并进行数据分析。

1.3.3 患者随访 术后对患者进行随访,随访时间从手术后至2020年6月30日,术后2年每3个月随访1次,术后3～5 年每6 个月随访1 次,获得患者生存情况,失访患者纳入死亡病例。

1.4 观察指标 分析CXCL16、CXCL6 在经过新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中的表达情况以及大肠癌组织中CXCL6、CXCL16 升高水平与化疗反应效果的关系。

1.5 判定标准 新辅助化疗后,癌组织面积可减少,该反应可用肿瘤退缩分级来表示,新辅助化疗后病理评分标准：无存活癌细胞,肿瘤退缩分级为0 级(完全反应)；单个或小簇癌细胞残留为1 级(中度反应)；残留癌灶版间质纤维化为2 级(轻度反应)；少数或无肿瘤细胞消退,大量癌细胞残留为3 级(反应不良)。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验,多组组间比较使用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 预后 随访98 例患者,失访3 例,随访率96.94%(95/98),95 例随访患者中死亡38 例,剩余57 例患者健康或带瘤生存,5 年总生存率为60.00%(57/95)。随着肿瘤对新辅助化疗反应性减弱,患者5 年死亡率明显升高。见表1。

2.2 CXCL16、CXCL6 在经过新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中的表达情况 免疫组化结果显示：CXCL6 和CXCL16 在新辅助化疗前在癌细胞中表达为弱阳性,二者在新辅助化疗后在癌细胞及部分癌周细胞中表达为强阳性。Western Blot 结果进一步验证了免疫组化结果,对照组肿瘤中CXCL6 和CXCL16 的水平低于新辅助化疗后,见图1a,1b。与管家基因蛋白GAPDH 相比的相对灰度值统计结果显示,CXCL6 和CXCL16 在对照组的表达分别为(1.25±0.19)、(0.22±0.03),均低于反应中度/完全患者的(1.87±0.14)、(0.51±0.07),CXCL16 在反应不良及反应轻度患者表达(0.43±0.09)高于对照组的(0.22±0.03),差异具有统计学意义(P<0.05)。CXCL16在反应不良/轻度患者的表达低于反应中度/完全患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1c,1d。

图1 新辅助化疗不同反应组肿瘤组织中CXCL6 及CXCL16 表达(Western Blot,GAPDH 做内参对照)。

通过对免疫组化结果对新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中CXCL6 和CXCL16 的表达分析,结果显示,术后癌组织与癌周组织中CXCL6 的0、1、2 级阳性率分别为(208±26)、(151±39)、(97±26)%均高于术前的(32±15)、(29±13)、(56±21)%,CXCL16的0、1、2 级阳性率分别为(228±36)、(198±46)、(123±21)%均高于术前的(77±27)、(86±38)、(87±32)%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1,2。同时通过单因素方差分析发现,CXCL6 在新辅助化疗治疗前及治疗后不同反应患者之间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。新辅助化疗治疗效果越好,治疗后CXCL6阳性率越高。CXCL16 在新辅助化疗治疗前不同反应患者中的阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05),而CXCL16 在新辅助化疗治疗后不同反应患者中的阳性率比较,差异具有统计学意义(P<0.05),即新辅助化疗治疗效果越好,治疗后CXCL16 阳性率越高。

表1 CXCL6 在经过新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中的表达情况(%,)

表1 CXCL6 在经过新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中的表达情况(%,)

注：与术前比较,aP<0.05

表2 CXCL16 在经过新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中的表达情况(%,)

表2 CXCL16 在经过新辅助化疗的大肠腺癌术前术后在癌组织及癌周组织中的表达情况(%,)

注：与术前比较,aP<0.05

3 讨论

既往研究表明,新辅助化疗可缩小肿瘤体积,易于根治性手术切除,减少切缘阳性的可能；同时降低肿瘤细胞术中脱落风险,降低患者的复发率和转移率,进而提高患者的术后生存率［5］。而作为微观来看新辅助化疗对癌组织及癌周组织的影响也是巨大的,肿瘤免疫微环境中的各组分在新辅助治疗后均发生显著性的改变,例如：瘤细胞表面与上皮间质转化(EMT)、肿瘤干细胞(CSC)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM),其中至关重要的是TIL,包括CD4、CD8、NKT 等免疫细胞的改变［6］,这些细胞增多可局部对癌细胞进行识别和清除,可能新辅助化疗对癌组织的破坏,导致机体对癌组织的趋化排斥反应,激活免疫细胞增多也可达到地毯式搜索并杀伤撒落血液的癌细胞,遏制癌细胞的转移［7］。

CXCL6 是一种属于CXC 趋化因子家族的小细胞因子,也被称为粒细胞趋化蛋白2。它通过与趋化因子受体CXC 趋化因子受体1(CXCR1)和CXC 趋化因子受体2(CXCR2)相互作用来诱导其趋化效应,从而到达调控血管生成、细胞运动性、免疫细胞浸润、微环境中细胞生长和存活以及调节局部抗肿瘤活性的作用和肿瘤免疫反应［8］。CXCL16 是一种膜结合趋化因子,一跨膜的形式存在TM-CXCL16 和被蛋白水解酶裂解的可溶性形成SCXCL16,CXCL16 在巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、B 细胞以及各种癌细胞系表达［9］。在经过新辅助化疗后的肿瘤微环境受到了干扰,引起风暴式的炎性反应,跟免疫炎症有关的细胞因子也会被大量的产生。

综上所述,新辅助化疗后大肠癌组织中CXCL6、CXCL16 表达较治疗前明显升高,且与化疗反应效果有关,同时由于新辅助化疗效果和患者预后(5 年生存率)有明确关系,故也可将CXCL6、CXCL16 在患者肿瘤中的表达尤其是治疗后的表达情况作为大肠癌患者预后的一个重要指标。