涤痰汤通过PKA/CREB通路对阿尔茨海默病模型大鼠脑内tau蛋白磷酸化及行为学的影响研究*

王 玥，杨 畅，金春峰

(辽宁中医药大学解剖组胚教研室，辽宁 沈阳 110847)

阿尔茨海默病(AD)属呆病范畴，由20世纪德国医生阿洛伊斯·阿尔茨海默发现，其机制复杂，临床表现为学习记忆功能障碍、认知功能障碍、语言障碍等。最新中医学研究显示，AD以肾虚尤甚的五脏虚衰为内在机制，痰浊为加速本病发展的重要因素，且五脏虚衰和痰浊两者互为因果、相互影响，最终导致AD的发生。目前，AD尚无有效的药物根治方法，会给社会及患者家庭带来沉重的负担。因此，如何预防AD发病及延缓AD病程已成为神经病理学领域的热点研究方向之一。

AD的主要病理学特征为：(1)大脑皮质、海马、杏仁核和丘脑中大量β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的老年斑(SP)；(2)大脑皮质和海马变性神经元内出现由过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经元纤维缠结(NFTs)。正常情况下，tau蛋白能够与神经元微管结合并促进微管的组装和稳定，并通过与多种蛋白相互作用来行使神经元的正常轴浆运输、维持突触可塑性和神经元存活等功能。然而，tau蛋白过度磷酸化后生物学活性降低，生理功能丧失，最终导致神经元内NFTs，细胞随之变性死亡，学习记忆功能受损。因此，tau蛋白过度磷酸化与AD发病关系密切，目前研究热点主要集中在抑制tau过度磷酸化和修复受损的神经元方面，但缺乏有效的中医中药治疗措施。

涤痰汤出自明代王肯堂的《证治准绳》，由茯苓、半夏、胆星、竹茹、枳实、人参、石菖蒲、甘草加生姜等组成，具有化浊开窍、益气祛痰等重要作用。相关研究显示，涤痰汤可逆转AD模型大鼠的空间记忆能力[1-2]，还可以改善老年认知功能障碍大鼠的学习记忆能力。其机制可能是通过下调海马γ-分泌酶的水平，进而降低海马SP水平[3]。涤痰汤可有效地抑制SP的沉积并改善AD模型的学习记忆能力，但涤痰汤能否抑制tau蛋白磷酸化及改善AD认知功能和学习障碍尚有待探讨。

1 材料与方法

1.1一般材料 选取250～300 g雄性SD大鼠，适应性喂养1周。设定白天、黑夜各为12 h，温度(25±1)℃，湿度45%～55%，自由进食水。将大鼠随机分为对照组、模型组、涤痰汤组、西药组，每组10只。对照组、模型组的大鼠常规麻醉后，利用脑立体定向仪固定大鼠头部，选择大鼠双侧海马CA1区(前卤后3.3 mm、中线外侧1.5 mm、硬脑膜下3.0 mm)，用微量进样器显微注射4 μL Aβ1-40(10 mg/mL)，匀速缓慢注射5 min，注射完毕后再留针5 min，缝合伤口。涤痰汤组大鼠常规麻醉后，利用脑立体定向仪固定大鼠头部，选择大鼠双侧海马CA1区(前卤后3.3 mm、中线外侧1.5 mm、硬脑膜下3.0 mm)，用微量进样器显微注射4 μL老化Aβ1-40(10 mg/mL)，匀速缓慢注射5 min，注射完毕后再留针5 min，缝合伤口。造模4 d后，涤痰汤组大鼠每天灌胃80 mg/kg涤痰汤，灌胃体积为2 mL，西药组大鼠给予哈伯因混悬液，其余组给予等体积的生理盐水，连续给药10 d。10 d后过量麻醉处死各组大鼠，取脑组织进行后续检测。

1.2方法

1.2.1药品制备 涤痰汤方中各药量分别为半夏7.5 g、茯苓6 g、胆星7.5 g、枳实6 g、竹茹2 g、人参3 g、石菖蒲3 g、甘草1.5 g、生姜2.5 g，购于辽宁中医药大学附属医院。该方先煎40 min，再煎30 min，药液混合过滤浓缩至1 g/mL，放于4 ℃冰箱储存备用。其他药品试剂包括：哈伯因(河南太龙药业股份有限公司，国药准字：H10940156)、全蛋白提取试剂盒(wanleibio)、BCA蛋白测定试剂盒(wanleibio)、ECL发光液(wanleibio)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、p-蛋白激酶A(p-PKA)、蛋白激酶A(PKA)、p-环腺苷酸反应元件结合蛋白(p-CREB)、环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)、tau(wanleibio)、p-tau(Affinity)、羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-HRP(wanleibio)、内参抗体β-actin(wanleibio)、NeuN(abcam)、p-tau S202(GeneTex)、FITC标记山羊抗小鼠IgG(Beyotime)、Cy3标记山羊抗兔IgG(Beyotime)、山羊血清(Solarbio)、DAPI(Beyotime)、抗荧光淬灭剂(Solarbio)。

1.2.2实验仪器 超纯水系统(Heal Force，型号：NW10LVF)，-70 ℃超低温冰箱(中科美菱，型号：DW HL-668)，超净工作台(苏州净化，型号：VD-850)，水平摇床(北京六一公司，型号：WD-9405B)，微量移液器(BIOHIT，型号：Proline)，电泳仪(北京六一公司，型号：DYY-7C)，转移槽(北京六一公司，型号：DYCZ-40D)，酶标仪(BIOTEK，型号：ELX-800)，显微镜型号(OLUMPUS，型号：BX53)，显微镜拍照系统(OLUMPUS，型号：DP73)。

1.2.3水迷宫 实验前，将水池水温加热至25 ℃左右，倒入牛奶，将池底背景染成白色，并在水池四周墙壁上标记不同形状的图形。Morris水迷宫设有4个象限，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，实验水池上方通过摄像镜头的影像跟踪系统与计算机相连，采用ZH0065 Plus Image Analyzer记录实验过程。实验进行时保持室内环境的安静。首先，在定位航行实验中，平台设在第三象限，露出水面约1.5 cm，各组大鼠均在第Ⅰ象限指定位置边缘入水，记录大鼠60 s内寻找到平台的时间。若大鼠未寻找到平台，则引导至平台，停留10 s。次日，将实验大鼠从第一象限贴壁放入水中，通过影像跟踪系统记录各组大鼠60 s内找到平台的时间(即逃避潜伏期)及所经过的路程，每只大鼠试验3次，时间间隔约30 min。在实验过程中，倘若有大鼠未找到平台，则时间记录为60 s。实验第3～4天进行隐蔽平台实验。在隐蔽平台实验中，平台位置及大鼠入水位置不变，水面超过平台1.5 cm，大鼠从入水到找到平台的时间即为逃避潜伏期。在水迷宫实验进行的第5天，撤去平台，进行空间探索实验，记录并分析大鼠的游泳轨迹、穿越平台的次数及各象限的停留时间等，并进行统计学处理，以此作为评价大鼠空间认知和记忆能力的指标。

1.2.4Western blotting检测 (1)蛋白质抽提与定量后，选用与目的蛋白相对分子质量相对应的聚丙烯酰胺凝胶，先配制分离胶，将混匀的液体沿玻璃板一侧灌入，上层用水封好以促进凝胶聚合；然后配制浓缩胶，水层倒掉后将浓缩胶缓慢灌入，最后用梳子封口，待胶完全凝固后即可拔出梳子。安装电泳槽，分别向电泳槽的正极和负极注入电泳液，每孔加入20 μL电泳蛋白上样液，最后加入5 μL蛋白Marker，连通电极，通常电泳条件为电压90 V，恒压电泳约为2 h。转膜的条件为电压90 V，冰水中转膜2 h。转印结束后取出PVDF，浸入TBST中，放于左右摇床摇动5 min，摇床3次。将PVDF浸入5%脱脂奶粉溶液中，摇床缓慢摇动封闭1 h。一抗4 ℃过夜。次日，将PVDF浸入TBST中，摇床摇动5 min，摇床3次。二抗孵育2 h。ECL底物发光，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的吸光度。

1.2.5免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微术 将切片架分别浸于Ⅰ级和Ⅱ级二甲苯中脱蜡各15 min。取出切片，依次浸入95%、85%、75%乙醇各1 min。磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗5 min，冲洗3次。置于煮沸抗原修复液中，低火修复10 min。PBS冲洗5 min，冲洗3次。使用滤纸片将每张切片擦干，免疫组化笔在组织周围画圈，防止滴加液体时外溢。滴加山羊血清于湿盒内室温15 min。取出切片，摆放在切片架上，PBS冲洗5 min，冲洗3次。一抗4 ℃过夜。PBS冲洗5 min，冲洗3次。以下操作注意避光，滴加荧光二抗(1∶200稀释的PBS)室温孵育60 min。PBS冲洗5 min，冲洗3次。滴加DAPI至完全覆盖组织以复染核。抗荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下观察染色效果，400倍镜下拍照(标尺长度50 μm)。

2 结 果

2.1涤痰汤对AD模型大鼠行为学的影响 学习记忆能力障碍是AD重要的症状之一。在对AD模型的学习记忆能力的评估中，水迷宫等行为学实验方法已成为检测实验动物学习记忆能力及空间探索能力的重要手段，也是判断痴呆的基本方法。结果显示，涤痰汤组、西药组大鼠前两天、后两天的平均逃避潜伏期和搜索平台的平均路程均显著低于模型组大鼠，但却略高于对照组大鼠，差异均有统计学意义(P<0.05)。在空间探索实验中，模型组大鼠运动轨迹多沿池壁或远离相应平台位置，而涤痰汤组和西药组大鼠的运动主要集中在相应平台位置，且其经过相应平台位置的次数明显高于模型组大鼠，表明涤痰汤灌胃干预后大鼠空间记忆能力得到改善，见图1、表1。

图1 空间探索实验中各组小鼠的运动轨迹

表1 各组小鼠不同实验时间的行为学情况

2.2涤痰汤对tau蛋白磷酸化的影响 变性坏死的神经细胞内会出现异常磷酸化的tau蛋白聚集而形成的NFTs，这是AD的主要神经病理特征之一。本研究结果显示，模型组大鼠脑内CA3区tau蛋白磷酸化水平显著高于对照组大鼠，而涤痰汤组和西药组大鼠脑内的tau蛋白磷酸化水平较模型组有所降低。同时，在涤痰汤的作用下，灌胃组大鼠脑内的神经元凋亡减少，可见涤痰汤神经保护作用显著。Western blotting结果显示，各组小鼠磷酸化tau蛋白表达水平中，模型组水平是对照组的(625.37±60.33)%，涤痰汤组是对照组的(167.95±23.57)%，西药组是对照组的(179.62±36.86)%，模型组与对照组比较、涤痰汤组和西药组与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 涤痰汤对tau蛋白磷酸化的影响

2.3基于PKA/CREB信号通路探讨涤痰汤对AD模型大鼠学习记忆能力的影响 记忆能力障碍、失语健忘、认知功能丧失及行为异常是AD最显著的特征，患者晚期可出现意识模糊甚至昏厥等现象。在中枢神经系统中，tau作为微管相关蛋白，可经过广泛翻译后修饰，而20多个不同表位的磷酸化位点大多数是苏氨酸(pThr)或丝氨酸(pSer)。结果显示，涤痰汤组和西药组大鼠p-PKA及p-CREB表达高于模型组大鼠，但却略低于对照组大鼠，见图3、表2。

图3 涤痰汤对PKA/CREB信号通路的影响

表2 各组小鼠p-PKA和p-CREB表达水平与对照组的比较

3 讨 论

研究结果显示，在以痰浊为患的多种病症治疗过程中，化痰益气法具有较好的疗效[4-6]。AD属中医老年呆病范畴，病机多以肾虚为本，以痰为标。中医理论认为，痰浊与AD关系密切，且痰浊有脏腑虚衰相互作用，加速AD发病及进展。老年人常有肾气虚衰表现，肾虚水无所主，脾虚不运水湿，而致湿浊内停，湿聚生痰，痰扰清灵则昏蒙呆钝。此外，关于痰浊促进呆症发病还有诸多文献书籍记载，如《丹溪心法》描述“五志之火因七情而起，郁而成痰”进而引发癫狂；《丹溪心法·健忘》提到“健忘者……亦有痰矣”；《石室秘录》介绍“痰气最盛，呆气最深”，因此，“治呆无奇法，治痰即治呆也”。由上可见，基于“从痰论治”相关理论，祛痰、化浊开窍等功效的中药可能成为AD的潜在治疗手段。

临床研究表明，涤痰汤可改善老年痴呆患者的临床症状，且疗效确切，但其作用机制尚不十分清楚[7]。涤痰汤是来自王肯堂的《证治准绳》经典方剂，由茯苓、半夏、胆星、竹茹、枳实、人参、石菖蒲、甘草、生姜等组成，其主要作用是涤痰开窍，益气祛痰。此方中大多数药物均能够延缓痴呆的发生，涤痰汤治疗AD疗效显著。如方中的石菖蒲，具有化湿开胃，开窍豁痰，醒神益智的功效，其活性成分可抑制胆碱能系统的酶活性；人参及其有效成分人参皂甙可起到抑制衰老、改善学习记忆功能等作用；半夏中的生物碱活性成分具有显著的燥湿化痰，镇咳化痰等作用；茯苓的主要生物活性成分具有抗氧化应激、调节免疫功能及镇静作用；枳实中的活性成分与多种中枢神经疾病相关[8]。相关研究显示，涤痰汤能够改善模型小鼠的学习记忆功能障碍[1-2]，还能降低乙酰胆碱酯酶(Ach E)的活性，并显著改善中枢胆碱能系统乙酰胆碱(ACh)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性，进而对AD所导致的中枢胆碱能系统受损具有保护作用[9]。由此可见，涤痰汤全方及组分中的药物可以延缓AD的发生及发展。神经元内出现由过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的NFTs是AD的神经病理学改变之一[10]。过度磷酸化tau蛋白可促使tau异常定位至树突，影响突触信息传递并介导早期学习记忆损伤[11]。此外，tau蛋白异常磷酸化形成NFTs会促进活性氧(ROS)产生，而ROS进一步引起炎性反应，间接影响神经元突触的正常功能并介导AD早期的学习记忆损伤[12-14]。因此，tau蛋白过度磷酸化在AD病变的发生、发展中起着关键作用，可能是导致脑萎缩和痴呆症状发生的直接原因。本实验通过免疫荧光、Western blotting及水迷宫方法考察了涤痰汤对AD模型大鼠脑内tau蛋白磷酸化水平的影响。研究结果表明，涤痰汤可明显下调AD模型大鼠脑内tau蛋白的磷酸化水平，且具有显著的脑保护作用，最终改善大鼠学习记忆功能。

此外，研究显示，PKA是cAMP最主要的效应分子，位于细胞核内的CREB主要调节启动子中具有CRE的基因转录，属于结构相关转录因子。PKA/CREB信号通路在脑损伤及再生修复过程中扮演着重要角色，并与中枢神经系统学习记忆关系密切。实验表明，长时程记忆的过程需要合成新蛋白质[15]，而在这一过程中，PKA/CREB信号通路发挥了重要作用[16-19]。此外，也有文献报道，在AD患者脑内，CREB水平或者CREB活性的表达下调均可引起tau蛋白异常过度表达，表明CREB在tau基因的转录调控中非常关键[20]。本研究通过Western blotting考察了涤痰汤改善模型大鼠学习记忆能力的具体效果，结果显示，涤痰汤组大鼠脑内磷酸化PKA、CREB水平显著高于模型组，提示涤痰汤可能激活PKA/CREB信号通路，上调了与学习记忆相关的蛋白水平，最终改善AD模型大鼠的学习记忆能力。