水产动物模型的建立及在病害防控上的研究进展

陈佳明，王庆，王英英，曾伟伟，尹纪元，李莹莹

1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部渔药创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广州 510380 2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306 3. 佛山科学技术学院， 广东省动物分子设计与精准育种重点实验室， 普遍高校动物分子设计与精准育种重点实验室，生命科学与工程学院，佛山 440605

随着世界人口的快速增长和工业化所带来的农用土地面积减少，传统的种植与畜牧业已不能满足人类日益增长的食物需求。与此同时，鱼类及其他水产生物正成为人类重要的食物来源[1]。在过去的30年里，水产养殖业取得了令人瞩目的进展，为世界上大部分人口提供了高质量的蛋白质。我国是水产养殖大国，是世界上唯一一个水产养殖产量超过捕捞产量的国家[2]。水产养殖业是推动我国渔业持续、快速和稳定发展的重要力量[3]。然而，鱼类病害问题发生频繁，造成了严重的经济损失，是我国目前水产养殖业发展的阻碍之一[4-5]。因此鱼类疾病的防控成为了水产养殖业发展所面临的重要问题。

传统的鱼类疾病防控方法是直接以受感染的鱼类为研究对象，寻求可控制该种疾病的方法。然而，一些鱼类养殖条件差异大、遗传背景不清楚，且国内无特定病原体(specefic pathogen free, SPF)实验动物，实验结果可信度较低，有时还会因为病原感染而影响结果的判断，阻碍了鱼类疾病的有效防控[6]。水产动物模型是人工培育出来的动物，其种源、饲养管理、繁殖生产、生活环境和营养饲料都有系统严格的科学要求，是遗传背景明确和来源清晰的，可用于替代其他生物进行生产、科学研究和检定等的动物[7]。近年来，水产动物模型逐渐应用于鱼病防治研究，借助水产动物模型为水产动物疾病的病原菌毒力分析、病原检测、传播途径研究及综合防治等提供有力的证据。例如，Rakus等[8]的研究表明，斑马鱼可作为鲑鱼呼肠孤病毒(chum salmon reovirus, CSV)和2种同种异型疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 1, CyHV-1；cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)的研究模型，利用斑马鱼动物模型，可以评估病毒清除过程，并在CSV-受感染的鱼中，可以研究宿主与病原体的长期对抗。Das等[9]以剑尾鱼为动物模型，研究水质和环境因素的变化对鱼类的健康和疾病易感性，表明气单胞菌(Aeromonas)是鱼类的主要病原体，证实了维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)的高致病性。水产动物模型的建立，将有效缓解鱼类疾病防控面临的诸多不便。

本文主要论述水产动物模型的建立方法，及其在鱼类疾病病原分析、水产疫苗开发和水质监测等方面的应用，为水产动物模型的应用推广提供参考。

1 水产动物模型的建立方法(Establishment method of aquatic animal model)

1.1 模型动物的选择

模型动物在试验研究中有双重作用，它既是研究对象，又是研究手段，在阐明动物疾病机理、预防及治疗等一系列的研究中都起着至关重要的作用[10]。建立水产动物模型试验中模型动物的选择是重要部分，模型动物的选择需主要符合以下几点：(1)可人工培育并能稳定传代；(2)子代多、世代短和遗传背景清楚；(3)易于试验操作。目前常用的水生模型动物有斑马鱼、稀有鮈鲫、青鳉、剑尾鱼、新月鱼、红鲫、丝足鱼、虹鳟、鲤鱼和尼罗罗非鱼等。

1.2 建立水产动物模型的原则

1.2.1 相似性

建立水产动物模型的目的是找出可以推广并应用于水生动物疾病研究的有关规律。然而，模型动物并不是水产养殖中的实际患病动物，因此应尽可能找到患病情况与实际患病动物近似的模型动物，即相似性。为了辨别所找到的模型动物是否与自然情况下的实际患病动物患病情况近似的一致，需要对模型动物进行病理学研究。例如，Renshaw等[11]建立了可通过产生特定嗜中性粒细胞的启动子下表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的转基因斑马鱼体内模型，用于炎症反应的遗传分析，通过对斑马鱼感染炎症的病原分析，发现斑马鱼的尾部被剪断后会引起炎症，而这种炎症随后会在与哺乳动物系统相似的时间过程中消退，证明斑马鱼可作为哺乳动物炎症诊治的水产动物模型。

1.2.2 重复性

理想的动物模型应具有良好的重复性[12]。例如，Tao等[13]和Guan等[14]都利用稀有鮈鲫模型，研究了水中双酚A对鱼类的影响。

1.2.3 适用性和可控性

所用的动物模型可人为地控制一些试验条件，以便于突出表现该疾病主要病症。用于医学试验研究的模型，应考虑到今后的临床应用以便于控制该疾病的研究发展，也利于该疾病模型研究的开展[15-16]。例如，笔者所在实验室以稀有鮈鲫为模型研究草鱼呼肠孤病毒，可人为地控制温度、剂量和攻毒方式等条件，以便于对该种疾病进行研究。

1.3 建立模型动物的方法

1.3.1 自发模型

自发模型是指试验动物在未经任何的化学处理下，动物自然发生或基因突变产生疾病。以J-db自发糖尿病小鼠模型为例，该小鼠出生即带有糖尿病致病基因，倪程佩等[17]比较了自发与诱发模型小鼠2型糖尿病的特征，发现8周后自发性2型糖尿病模型糖代谢异常以及炎症反应都日渐加重，长时间维持高血糖症状；诱发性2型糖尿病模型在饲养8周后糖代谢以及炎症反应部分缓解，高血糖症状部分好转。这证明，自发模型和诱发模型在实验中可能存在不同研究结果。自发模型是经遗传育种保留下来的动物，自发模型的建立具有十分重要的参考价值。然而，水产动物模型作为一类新兴的动物模型，目前极少存在自发模型的建立，预计在不久的将来，这个领域的研究将会有新的进展。

1.3.2 诱发模型

诱发模型是指试验者通过一定的化学、物理或生物的致病因素作用于试验动物，造成患有疾病的动物模型。生物因素致病是目前研究常用的手段，生物因素包括细菌、病毒、寄生虫、细胞、生物毒素和激素等。如Saraceni等[18]用嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophilia, AH)感染斑马鱼模型，并通过用实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system, qRT-PCR)检测基因表达，分析炎症相关基因表达，结果表明，斑马鱼可作为嗜水气单胞菌感染模型。Ahmadifard等[19]以剑尾鱼为模型，研究了富集枯草芽孢杆菌的青蒿对观赏鱼的影响，实验组长期饲喂添加枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的富集蒿属植物，结果表明，枯草杆菌培养期间浓度为1×105CFU·mL-1的枯草杆菌可以改善剑尾鱼的繁殖性能、肠道菌群和对病原菌的抗性。Lin等[20]将草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)通过腹腔注射的方式感染稀有鮈鲫，采用BGISEQ-500对肝胰腺、鳃、头肾和脾脏4个cDNA文库进行转录组测序，并采用qRT-PCR方法进行验证，探索发病机制。建立诱发模型的理想目的是在确认水产动物模型的种类、使用药物、剂量和方法之后，可以容易地再造和重复，同时，这样的过程也使得鱼病预防的方式得到实践和创新。

1.3.3 遗传修饰模型

遗传修饰模型是利用基因克隆、基因敲除和转基因等技术作用于动物，患有疾病的动物模型。随着现代分子生物技术在水产动物模型研究中的应用，水产动物遗传修饰模型的研究正经历着从宏观到微观的过程，从动物模型的群体、个体和细胞水平正向着分子水平方向发展，从分子水平上阐明生命的现象和疾病的本质[6]。Chen等[21]为了研究整合素βl(integrinβl subunit, ITGB 1b)对GCRV的感染作用，以稀有鮈鲫为动物模型，使用CRISPR/Cas9系统产生了ITGB 1b缺失的稀有鮈鲫(ITGB 1b-/-)。GCRV攻毒后，ITGB 1b-/-稀有鮈鲫的存活时间较野生型稀有鮈鲫长，这些发现为GCRV的防治提供了新的研究思路。冯志桐等[22]以转基因斑马鱼Tg(lyz：EGFP)-Lyz fish为模型探讨了重金属镉对转基因斑马鱼的胚胎毒性和免疫毒性，结果表明，转基因斑马鱼对镉的免疫性更强，转基因斑马鱼模型的建立在环境污染物的免疫毒性检测方面有着重要意义。遗传修饰水产动物模型是对已知基因加以修饰建立的，能够作为工具，帮助实现其他目的基因修饰动物模型。遗传修饰水产动物模型在基因功能和信号通路等生物学基础研究方面做出了突出贡献。

2 水产动物模型在鱼类疾病防控中的应用(Application of aquatic animal model in fish disease prevention and control)

2.1 水产动物模型在鱼类疾病病原分析中的应用

鱼类疾病诊断中病原分离和鉴定对疾病防治具有至关重要的作用，回归感染试验确定病原致病性是鱼病研究中常用的方法，但是一些鱼类具有体型大、饲养难、价格昂贵和不易繁殖等特点，阻碍了试验进行，因此，需用水产动物模型进行相关研究。稀有鮈鲫、斑马鱼、剑尾鱼和异育银鲫等都普遍作为疾病模型应用于鱼病病原分析研究，研究要求遗传背景清晰、来源清楚和雌雄比例相当的1～6月龄鱼。1994年，王铁辉等[23]研究稀有鮈鲫对GCRV的敏感性，通过对感染呼肠孤病毒后的病理观察，证明稀有鮈鲫对GCRV敏感，可作为抗GCRV育种的模型。2000年，潘厚军等[24]用18株从淡水鱼中分离出来的细菌感染剑尾鱼模型，发现细菌对剑尾鱼和敏感鱼的毒力一致，证明剑尾鱼模型作为评价水生细菌毒力的水生动物模型具有较好的前景。2007年，Harriff等[25]用2种海洋分枝杆菌(Mycobacteriumbalnei)感染斑马鱼，分别从鱼体的肝脏、脾脏和肠道分离到该细菌。组织病理分析发现，海洋分枝杆菌可以通过肠道感染鱼体，在内脏形成肉芽肿。2016年，夏立群等[26]通过对鰤鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolea)感染斑马鱼后的病理研究，建立了鰤鱼诺卡氏菌感染斑马鱼模型，该动物模型的建立将有助于诺卡氏菌病致病机理的研究和疫苗的研制。2016年，Yuan等[27]以稀有鮈鲫为动物模型，探索Cr6+积累和消除的动态规律，揭示其解毒和抗氧化的机理，对Cr6+中毒稀有鮈鲫进行分析，发现谷胱甘肽巯基转移酶蛋白(GST)和金属硫蛋白(MT)可能参与了Cr6+的解毒作用，此外，Cr6+诱导的稀有鮈鲫GST解毒可能是通过Nrf2介导的基因表达调控完成的。2018年，Rozi等[28]以丝足鱼为动物模型，研究来自东爪哇和中爪哇地区水域中5株嗜水气单胞菌对丝足鱼的致病性及组织病理特性，结果表明，3株为致病菌，2株为非致病菌，致病菌的组织病理特性可为感染病原菌的水生动物提供依据。同年，Boucontet等[29]使用亚致死剂量的辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)和福氏志贺菌(Shigellaflexneribacteria)来建立病毒和细菌共感染的斑马鱼模型，进行病原分析后发现，病毒诱发Ⅰ型干扰素(IFN)的反应，而细菌引发强烈IL1β和TNFα炎症反应。与单纯感染细菌的鱼相比，同时感染病毒的鱼死亡率更高，相比之下，先感染细菌后感染病毒并没有导致死亡率的增加，病毒-细菌共感染的鱼中性粒细胞存活受损，在共感染的鱼中强烈诱导了2种类型的细胞因子反应。2019年，谭宏亮等[30]以异育银鲫为动物模型，研究白藜芦醇对嗜水气单胞菌的毒力抑制作用，结果显示，大黄、虎杖等含白藜芦醇成分的药用植物具有效抑制嗜水气单胞菌毒力、降低鱼体炎症反应的功效；腹腔注射25～100 mg·kg-1白藜芦醇对感染病原菌的异育银鲫有一定保护作用，可用于水产细菌病防控。

2.2 水产动物模型在水产疫苗开发中的应用

目前，鱼类传染性疾病的防控主要有免疫预防和药物控制等方法。其中，由药物控制引起的变态反应、耐药性反应和中毒反应等潜在危害很大，对养殖动物、养殖产品、食用者和环境具有严重影响；而免疫预防不仅可以提高鱼类体内特异性免疫水平，亦能增强其机体抗应激的能力[31]。渔用疫苗的研制与应用一直是水产病害防治的重要研究方向之一，水产动物模型在疫苗研发方面的应用空间十分广阔。斑马鱼、稀有鮈鲫、剑尾鱼和虹鳟鱼等常被用作疫苗研发的实验鱼，要求为遗传背景清晰、来源清楚和雌雄比例相当的1～6月龄鱼。2010年，乔迁[32]以剑尾鱼作为动物模型，评价大菱鲆红体病虹彩病毒基因疫苗(pVAX1 25R、pVAX1 47R)对大菱虾红体病的治疗效果，结果表明，pVAX1 47R疫苗对预防大菱虾红体病具有一定的保护作用。2013年，张智慧[33]完成了鳗弧菌减毒活疫苗注射免疫斑马鱼的免疫保护分析，使用疫苗后相对免疫保护率达到90%以上，与在牙鲆等经济鱼种上的结果类似，说明斑马鱼经疫苗免疫后产生跟宿主动物类似的保护作用，可作为疫苗免疫效果评价和保护机理研究的动物模型。2015年，LaPatra等[34]以虹鳟鱼为动物模型，研究传染性造血坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)和肠道红口病(enteric red mouth vaccines, ERM)的双重疫苗使用鼻腔途径接种的情况，结果显示，通过鼻腔途径对2种病原体进行双重接种是一种非常有效的水产养殖疫苗接种策略。2017年，Marana等[35]同样以虹鳟鱼为动物模型，研究沙门氏菌灭活疫苗中抗原浓度对疫苗效力的影响，发现沙门氏菌灭活疫苗中抗原浓度与免疫保护力呈正相关。2018年，Myllymäki等[36]以斑马鱼为动物模型，用分歧杆菌低剂量腹腔注射感染斑马鱼，研究潜伏性海洋分枝杆菌感染重新激活机制，试验证明斑马鱼感染模型为研究海洋分枝杆菌感染的再活化机制、筛选疫苗和候选药物提供了一种可行的工具。2019年，Ramírez-Paredes等[37]以尼罗罗非鱼为动物模型，研制了一种弗朗西斯氏菌病(Franciscosis)的全细胞福尔马林灭活疫苗，接种疫苗840 d后，相对免疫保护率达到100%。

2.3 水产动物模型在水质监测方面的应用

在过去的30年中，世界水产养殖总产量以每年8%的速度增长[38]，到2030年，世界近2/3的水产品将来自于水产养殖业[39-40]。在养殖期间，水生环境为淡水和海洋生物提供了生活环境、食物和氧气。但由于环境污染、人类活动和农业生产等原因影响水环境中的溶解氧含量、温度和酸碱度等指标，从而影响水生生物的生长并引起鱼类疾病。因此，水质参数的监控调节是水产养殖过程的必要环节。水产动物模型在水质监测中的应用十分广泛。斑马鱼、稀有鮈鲫、新月鱼和青鳉常被用来检测水毒性，其中稀有鮈鲫的应用最为广泛，大多选育遗传背景清晰、雌雄比例相当的幼年或胚胎实验鱼进行各个生命阶段的毒性影响研究，或选用成年实验鱼对水体污染物的毒性进行研究。Sadeghi和Imanpoor[41]研究了水体中农药残留的各个成分对新月鱼模型的影响，证明新月鱼可作为水体质量检测的模型。Yang等[42]以斑马鱼为动物模型，对水中噻唑胺的毒性进行了研究，96 h-LC50值分别为：成鱼(4.19 mg·L-1)<仔鱼(3.52 mg·L-1)<胚胎(3.08 mg·L-1)，在斑马鱼的这3个阶段中感染噻唑胺的症状包括异常的自发运动、心跳缓慢、孵化抑制、生长退化和形态畸形，此外，成年斑马鱼暴露于0.19、1.33和2.76 mg·L-1噻唑胺后21 d，肝脏和肾脏有明显的病理变化。Liang和Zha[43]通过稀有鮈鲫对新型水质污染物苯丙三唑的内分泌干扰作用和神经毒性进行研究，证实稀有鮈鲫是水生毒性试验和化学安全评价的优良模型动物。Luo等[44]同样以稀有鮈鲫为模型动物，研究水环境中含氮污染物(氨、亚硝酸盐和硝酸盐)对水生生物早期生命阶段的影响，结果表明，氨、亚硝酸盐和硝酸盐对稀有鮈鲫生长无明显影响的浓度分别为2.49、13.33和19.95 mg·L-1，含氮污染物对稀有鮈鲫的生长构成了威胁，为建立含氮污染物水质标准提供了有益的信息。廖伟等[45]以斑马鱼为动物模型，研究斑马鱼不同生长时期对Cu2+的毒性响应差异，并利用物种敏感度分布法表征不同生长阶段斑马鱼对Cu2+的敏感性差异，结果证实，斑马鱼体长、体质量的变化均符合逻辑斯蒂增长方程(R2>0.97)，斑马鱼成鱼阶段对Cu2+较敏感，而幼鱼的敏感性次之，仔鱼最不敏感，此研究为水质基准的设计提供了依据。2019年，Guan等[46]通过研究水体中双酚A对稀有鮈鲫模型脂质代谢的调控机制及卵巢发育的影响，证明稀有鮈鲫可作为水体中双酚A的检测模型，是优良的水产毒理学研究的动物模型。

3 前景展望(Prospect forecast)

水生动物模型在科学研究中的建立和应用始于20世纪80年代，1981年Streisinger在Nature发表了一篇有关斑马鱼雌核发育和纯系建立的文章，标志着水生动物模型研究的开始[47]。水产动物模型具备遗传背景清晰、条件可控性强等优点，目前，关于水产动物模型的研究已不再局限于在模型动物群体的研究，基因克隆[48-49]、基因敲除[50-52]、蛋白定位[53-54]、细胞因子[55-56]和转录水平[57-59]等分子水平的研究在不断深入。此外，构建基因突变文库[60]、转基因模型生物研究[61]、反向基因筛查技术[62-64]和高通量基因定位[65]等新型研究手段的出现对水产动物疾病模型构建和应用具有较大推动作用。

然而，水产动物模型的标准化研究仍处于初步阶段，目前国际认可的应用于疾病研究的标准化水产动物模型仅有斑马鱼、青鳉、黑头软口鲦和孔雀鱼等。近几年，我国重视水生模型动物的研究与应用开发，加强选育工作，已陆续开展了剑尾鱼、稀有鮈鲫、红鲫和剑尾鱼等优良的水生动物模型的标准化研究，而对于其他模型动物的标准化研究还有待开发。水产动物模型作为一种新手段在水生动物疾病预防研究中具有广阔的发展空间。

动物模型是医学、生命科学研究的基础和重要支撑条件之一，反映了一个国家或地区科技综合能力的高低，是评价这个国家或地区生命科学水平高低的重要标志之一。水产动物模型具有种类多、繁殖力强和遗传容易控制等诸多优点，逐渐被应用到水产动物疾病模型复制及病原致病机理等方面研究。最近20多年，世界各国用鱼类在鱼病防治实验研究中已取得很多科研成果，发表的科研论文已达数千篇，应用价值已日益为人们所重视。水产动物模型将在水产养殖病害综合防治中得到愈来愈广泛的应用。

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