低温胁迫下北方林蛙冷冻保护剂系统研究进展

李玉莹 金莉莉 王秋雨

(辽宁大学生命科学院，沈阳，110036)

林蛙属(Rana)物种是一类具有鼓膜和背侧褶皱，脚趾有蹼，颞面黑色，非繁殖期在山林生活的棕色蛙类，在欧洲，林蛙因为其棕褐色的皮肤，也被叫作棕蛙(brown frog)[1-3]，是最广为人知的两栖动物之一。林蛙俗称哈什蟆，隶属两栖纲(Amphibia)，无尾目(Anura)，蛙科(Ranidae)，林蛙属[1]。1785年，林奈将欧洲蛙定名为Ranatemporaria，时至今日林蛙在全球命名已有40余种，我国有17个林蛙的独立有效物种[2，4]。林蛙不仅在中国分布广泛，在俄罗斯远东、蒙古东部、朝鲜半岛、日本北海道等地区均有分布[2]。其中，分布于北方的林蛙具有冬眠期。9月以后天气转凉，温度降到10℃以下时，东北林蛙(R.dybowskii)陆续回到水下或者藏身在地下，进入冬眠期[5]。Voituron等[6]也发现相似的行为现象，观察到在0℃以下的初冬，田野林蛙(R.arvalis)从池塘中出来并在上部土壤和枯枝落叶层中冬眠。这些林蛙具有耐冻性，为自身在零下温度环境下的存活提供了保障。耐冻性是指在低温条件下的生物能够忍受细胞外和器官外空间结冰而不死亡的性质[7-8]。生活在亚北极地区的林蛙如R.sylvatica能够在低至-16℃的温度，65%的身体水冻结的环境条件下存活[9]。除此之外，对林蛙属的其他物种如黑龙江林蛙(R.amure-nsis)、豹蛙(R.pipiens)和欧洲绿蛙(R.ridibunda)等的耐冻性也均有报道[10-12]。笔者综述了分布于北方的林蛙在低温胁迫下冷冻保护系统的研究进展，旨在为从事相关研究的科学工作者提供参考。

1 北方林蛙的冷冻保护系统

随着对林蛙耐冻性的不断深入研究，学者们发现林蛙体内存在一套冷冻保护剂系统，使其在冬季的冷冻中存活，葡萄糖和尿素是2种主要的冷冻保护剂[13]。二者都可以通过积极的作用来限制体内冰的形成，且两者都可以提供特殊的作用，包括调节代谢和抗氧化等，以保护生物膜和大分子免受离子渗透扰动[14]。

1.1 冷冻保护剂——葡萄糖

1.1.1 糖原的储存与来源

葡萄糖在低温下对林蛙有保护作用，升高的葡萄糖水平可以降低林蛙体内冰的含量和体内红细胞的损伤，组织中葡萄糖水平是决定林蛙冷冻耐受能力的关键因素[15]。糖原是一种重要的冬季能量储备方式，也是耐寒林蛙冷冻保护剂葡萄糖的主要来源。林蛙体内的糖原在夏末和秋季积累，在冬季和春季消耗[16]。因此，肝脏中的糖原含量在冬季开始时最高，春季产卵后最小，林蛙的糖原贮存库呈现出明显的季节性模式[17]。

某些蛙类冬眠前脂肪体的脂解作用会增加，用来支持糖原的生成。在秋季糖原储备阶段，牛蛙(R.catesbeiana)的脂质存储降低，脂质代谢使血糖被分流到糖原中[18]。Costanzo等[9]的研究也发现，林蛙在糖原沉积期间大大消耗了它们的脂肪。脂肪氧化代谢是耗氧过程，而林蛙冬眠期间处于缺氧状态[19]，所以脂肪不能在缺氧的冷冻组织中被氧化。然而在冬眠准备期，林蛙将体内脂肪分解代谢，产生大量的糖异生前体(如甘油三酸酯的甘油部分)，这有助于建立肝糖原贮备库，对林蛙安全度过冬眠期具有重要意义[14]。

林蛙体内的糖原储存，还依赖蛋白质的分解代谢。在冬季适应过程中林蛙腓肠肌尺寸减小27%，蛋白质的净流失加速导致肌肉萎缩[9]。大鼠腓肠肌萎缩实验证实，肌肉萎缩由一组名为“atrogenes”的基因诱导调控，在全身消瘦状态(禁食，癌症恶病质，肾衰竭，糖尿病)期间，atrogenes基因的表达在肌肉中被协同诱导或抑制，其中泛素连接酶atrogin-1、MuRF1和萎缩诱导转录因子FoxO1对于产生和维持“萎缩”状态至关重要[20]。冬季林蛙血浆内的游离氨基酸比夏末时期多130%—150%，而苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸等多种糖原性氨基酸的增加，可能会增加冬眠前糖原的合成，甚至可能维持冬眠期间主要的代谢，因此Costanzo等[13]认为蛋白质分解代谢对林蛙冬眠的准备起着重要和尚未被清晰认知的作用。

1.1.2 葡萄糖动员

冬眠的林蛙能够应对冷冻而产生强烈的葡萄糖反应。-2.5℃下冷冻48 h的林蛙R.sylvatica体内葡萄糖的质量摩尔浓度比未冷冻的高54—80倍，且葡萄糖水平因器官而异，在肝脏中最高，在骨骼肌中最低，然而这些葡萄糖仅仅是糖原储存的39%[9]。林蛙遇到更低的温度，或是温度升高和降低的循环时，葡萄糖反应更为剧烈。实验条件下直接冷冻至-8或-16℃时，林蛙的糖原质量摩尔浓度降低了2/3，循环冷冻/解冻处理的林蛙糖原质量摩尔浓度降低近95%[13]。

林蛙在冬季可以忍受长时间的全身冷冻，得益于广泛的糖原水解和高输出的葡萄糖质量摩尔浓度在血液和所有组织中的分布。遭遇低温后，林蛙体内迅速进行葡萄糖动员：①通过活化体内肝脏糖原磷酸化酶(GP)，并抑制糖酵解过程的关键酶6-磷酸果糖激酶(PFK)，从而保证了所需的高度糖原分解速率[21]；②林蛙通过增加GP活性和蛋白激酶A(PKA)活性，增强了葡萄糖动员期的糖原分解作用[22]；③林蛙冻结时可激活糖原合成酶激酶3(GSK-3)，并将其下游底物磷酸化，阻止糖原合成。GSK-3的动力学特性对温度变化结果显示，冷冻林蛙中的GSK-3比未冻结的林蛙更容易将下游目标磷酸化[23]。冷冻保护剂葡萄糖动员完成后，林蛙通过降低GP的活性来调节其糖原分解反应，从而保留了肝糖原储备[22]。

葡萄糖冷冻保护剂系统的功效不仅取决于糖原分解的速率，还取决于肝细胞输出游离葡萄糖的速度。葡萄糖转运蛋白是一种特殊的载体蛋白，在葡萄糖跨细胞膜的转运中发挥作用。在所有脊椎动物中，葡萄糖转运蛋白对葡萄糖稳态的维持起着重要作用，特别是在生理应激时期。比如，低氧时葡萄糖转运蛋白的变化有利于葡萄糖的利用，葡萄糖作为代谢能量的来源，保护细胞免受缺氧损伤[24]。Rosendale等[25]发现在冷冻条件下，林蛙肝脏葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)的蛋白丰度和mRNA表达增加，说明GLUT2在林蛙冷冻存活中起着重要作用。

1.2 冷冻保护剂——尿素

尿素转运蛋白(UTs)存在于哺乳动物、鱼类、爬行动物和两栖动物等生物体中。哺乳动物体内UTs参与了多种生理过程，如：肾脏的尿液浓度调节、肠道中的氮循环回收[28]。目前，UTs在耐寒林蛙越冬中的生理作用知之甚少。Rosendale等[25]的研究发现林蛙体内UTs数量随季节变化，免疫印迹技术表明秋季和冬季的UTs丰度较低，春季则较高。体内UTs的升高可能是由精氨酸血管收缩素(AVT)水平升高引起[29]。

冷冻过程中肝脏中尿素的产生对于林蛙冬季成功存活至关重要。氨基甲酸酯磷酸合成酶1(CPS1)是尿素合成的限速酶。CPS1的动力学参数表明，林蛙冷冻期间肝脏中的CPS1被翻译后修饰，以增加CPS1活性[30]。Hawkins等[31]对林蛙的磷酸化蛋白质组学分析表明，CPS1、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶1(ARG1)3种尿素循环酶在冷冻、缺氧或脱水暴露时被差异磷酸化。这3种尿素循环酶受到应激反应发生可逆翻译后调控。谷氨酸脱氢酶(GDH)是尿素生成的一种关键酶，GDH分解谷氨酸和NAD+生成马-酮戊二酸(a-KG)、NADH和铵，可代谢形成尿素。冷冻的林蛙GDH受到翻译后修饰的调节，以满足尿素生成的需要[32]。

2 总结与展望

2.1 总结

分布于北方的林蛙在长期的低温环境下，进化出一系列生理生化机制来应对低温带来的损伤，其中研究最为广泛的是林蛙体内的冷冻保护系统，由尿素和葡萄糖组成。二者都可以限制冰的形成，且两者都可以提供特殊的作用，包括调节代谢和抗氧化，以保护生物膜和大分子免受离子渗透扰动[14]。在秋季，林蛙体内糖原含量增加，脂质代谢和蛋白质分解以便糖原贮存。当林蛙遭遇低温时，通过促进糖酵解并抑制糖异生，在体内迅速产生大量的冷冻保护剂——葡萄糖。葡萄糖动员完成后抑制糖原合成，以保证体内足够的葡萄糖水平(图1)。

2005年，Costanzo等[26]首次发现尿素在林蛙的耐冻性中起着重要的作用。除了能够限制冰的形成，还能防止葡萄糖无法阻止的冻融损伤发生[26-27]。低温条件下，尿素转运蛋白及尿素生成的相关酶受到调节，以满足林蛙冬季生存需要(图2)。

2.2 展望

林蛙在冬季经历多种生理应激，如冷冻、脱水和低氧等，实验证实低氧可能是造成冷冻引起的GLUT2丰度变化的原因之一[25]。但是葡萄糖动员期间糖酵解和糖异生相关酶等的调节具体响应什么生理应激而变化，还需要继续探究。尿素调节相关的多种酶受到翻译后修饰，如：CPS1、ARG1和ASL。但是这种翻译后修饰在控制冰冻，缺氧或脱水暴露而在肝脏中起到的作用尚不清楚，还需要继续探究[31]。

近些年，microRNA成为国内外科学家们的研究热点，有研究发现林蛙microRNA组织特异性表达：解冻过程中心脏中的21种microRNA表达减少，这些microRNA的减少有利于心脏功能的快速恢复；冷冻的骨骼肌有16种microRNA表达增加，这些microRNA增加有利于抑制代谢节省能量，差异表达的microRNA在林蛙冷冻存活中起着重要作用[33]。然而对耐寒林蛙葡萄糖动员、尿素积累和动员过程相关的microRNA调控机制还未见报道。对耐寒蛙冷冻期间microRNA的相关研究，将有助于了解林蛙冷冻期间发生在转录水平的调控。

自然环境下冬眠的林蛙经常因为气温变化导致自身经历连续冷冻和解冻过程，从而积累更多的葡萄糖[34]，且解冻后仍保持高血糖质量摩尔浓度[9]。有研究表明，耐冻林蛙的胰岛素结构与其他不耐冻的蛙类不同，美国牛蛙不耐冻，欧洲绿蛙具有耐冻性，胰岛素分子结构的选择性改变可能削弱了与胰岛素受体的结合，并导致葡萄糖浓度的异常升高[35]。这些现象与二型糖尿病的发病机制和生理特点契合[36]，所以对冬眠林蛙在高浓度葡萄糖水平条件下生存的机制研究，或许对解决糖尿病问题具有一定的指导意义。

近年来，有学者发现与来自南方地区的林蛙相比，生活在亚北极圈的林蛙具有更强的耐冻性，能够在更长的低温时间和更低的温度下生存[14]。早些年就有学者提出林蛙的种群随着纬度不同而表现出不同的耐冻性和适应能力[37]。通过对耐冻林蛙越冬生存机理的研究，可以提高人们对林蛙地理分布和演化过程的理解。现代分子生物学技术的快速发展为研究林蛙越冬的生理生化机制提供了有利条件，利用高通量测序技术分析南北地区林蛙基因序列的差异性，可以更好地理解林蛙的地理分布和演化过程。