用Biolog-ECO板分析动物笼舍环境微生物

王兴金 萨家祺 李冠惠 黎绘宏 成世清

(广州动物园，广州市野生动物研究中心，广州，510070)

动物的生活环境，包括微生物环境，与动物健康的关系非常密切，不仅因为致病微生物危害动物健康，环境微生物群落还可能通过影响动物肠道菌群而对动物健康产生间接影响。研究表明，圈养和野生大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)肠道微生物群落存在一定差异，与其栖息环境、食物资源、活动节律等的影响密切相关[1]。为探讨动物笼舍环境微生物，分别从广州动物园灵长类(Primates)、爬行类(Reptilia)动物笼舍收集了15个环境样本，并采用Biolog-Eco方法进行分析，以期了解动物园动物笼舍环境微生物活性及其影响因素，为更好地养护野生动物提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品及处理

样本采集和处理：在动物笼舍的四周及中央部位无菌采集5处垫材样本，共约10 g，按m(样本)∶V(灭菌蒸馏水)=1 g∶9 mL的比例处理样品后，置恒温振荡箱中，4℃振荡1 h，取上清液用灭菌蒸馏水稀释10倍后接种ECO板，150 μL/孔，37℃培养，每24 h分别读取OD590和OD750值。样本来源见表1。

表1 动物笼舍垫材样本来源

1.2 数据分析

微生物代谢活性用平均颜色变化率(average well color development，AWCD，量符号为DAWC)表示，其计算方法为：

DAWC=∑(C-R)/n

式中：C为每个碳源孔在590 nm下的吸光度值减去750 nm下的吸光度值；R为对照孔的吸光度值；n为培养基碳源种类数。当C-R的数值小于0.06时矫正为0处理[2-3]。

对得到的AWCD数据分别采用SPSS 17.0进行方差分析、vegan v2.5-6进行主成分分析、flashClust v1.01-2进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 各样本对ECO板碳源的利用情况

AWCD值反映了样本中微生物的代谢活性，即对碳源的利用能力。15个样本中微生物利用全部31种碳源的AWCD变化曲线如图1A所示。大部分样本在24—48 h的AWCD曲线斜率最大，此前、后曲线斜率均较低，在96—120 h基本稳定。但来自垫材C的S11、S15、S13样本的AWCD曲线斜率在24 h内最大，此后变化趋于平缓；S1的AWCD绝对值虽然较低，但上升趋势明显。

选择培养96 h的各样本的AWCD值进行方差分析，结果15个样品对碳源的利用存在极显著的差异(P<0.01，表2)；对各样本的AWCD值进行多重比较(multiple comparisons)，发现S11除与S1没有显著差异(P>0.05)外，均极显著低于其他各样本(P<0.01)；而S1除了与S3、S9、S11、S13、S15无显著差异(P>0.05)外，均极显著低于其他样本(P<0.01，表3)。从绝对数值看，AWCD值排在最低的5个样本依次为S11、S1、S15、S3、S13，其中S11、S13、S15均为垫材C，S1、S3为垫材A。

表2 动物笼舍垫材样本对碳源利用的AWCD的方差分析结果

为了进一步分析各样本微生物对ECO板中不同类型碳源的利用情况，将ECO板的31种碳源分为6大类[4]，分别计算各样本利用每类碳源的AWCD值，并进行方差分析(表2)。结果，15个样本对碳水化合物、氨基酸、胺类等3类碳源的利用存在极显著差异(P<0.01)，而对羧酸、多聚物、酚酸类等碳源的利用差异不显著(P>0.05)。

对存在差异的碳水化合物、氨基酸、胺类3类碳源利用的AWCD值进行样本间多重比较(表3)。结果，在对碳水化合物的利用上，S11除与S1、S9、S15无显著差异(P>0.05)外，极显著低于其他各样本(P<0.01)，S15的AWCD值也极显著低于S4、S6、S14(P<0.01)；在对氨基酸的利用上，S1极显著低于S4、S5、S7、S10、S12、S14(P<0.01)，S11极显著低于S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14(P<0.01)，S13极显著低于S14(P<0.01)；对胺类的利用上，S1极显著低于S2、S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14、S15(P<0.01)。整体上，S11、S1、S15、S13对碳源的利用活性较低，除S1外其他3个都是垫材C样本。

表3 动物笼舍垫材样本对碳源利用的AWCD的post hoc检验结果(仅显示P<0.05)

存在样本间差异的碳水化合物、氨基酸、胺类3类碳源的AWCD随培养时间的变化曲线显示：对碳水化合物的利用，来自垫材C的S11、S13、S15样本在24 h内曲线斜率最大，此后较明显地变平缓或下降，而其他样本在48 h前的曲线斜率均较大(图1B)；对氨基酸的利用，S11、S13、S15样本的曲线斜率在24 h内最大，而其他样本的曲线斜率最大值出现在24—48 h，且曲线向上的趋势持续时间更长(图1C)；对胺类的利用，S11和S15的曲线斜率在24 h达到最大值，S13则在24—48 h达到最大值，但随后的曲线斜率均下降较快，而其他样本的曲线向上的持续时间更长，S1的绝对值虽然较低，却呈现持续向上的趋势(图1D)。

将培养72、96、120 h AWCD较高的前6个样本从高到低进行排序(表4)。结果可见，在对全部31种碳源利用活性较高的样本中均出现了S4、S5、S7、S10、S14样本，此外S2、S12各出现1次。其中，除S7为垫材B外，其余样本均来自垫材A，而垫材C样本没有出现在其中。将碳源分为6大类后，在前述培养时间段，仅对酚酸类的利用中出现了1个垫材C样本，对其余5类碳源的利用中均未出现垫材C样本(即S11、S13、S15)。此外，S1和S3也未出现在表4中。

表4 不同培养时间动物笼舍垫材对碳源利用活性排名前6的样本

2.2 相同环境样本AWCD的差异性

在所有15个样本中，4个来自黑猩猩的环境样本(S6、S7、S8、S9)各种条件最为一致，即动物种类相同、日常管理相同、垫材类型相同。4个样本培养96 h后的AWCD仅对碳水化合物的利用上存在显著差异(P<0.05)，即S6对碳水化合物的利用活性显著高于S9(P<0.05)，其他样本对各类碳源的利用均差异不显著(P>0.05，表5)。提示，在动物种类、垫材类型、日常管理方法等条件相似的情况下，环境微生物活性也比较相似。

表5 黑猩猩笼舍垫材样本(S6、S7、S8、S9)AWCD的方差分析结果

2.3 主成分与聚类分析

为进一步探究各样本微生物对碳源利用的相互关系，对培养96 h后的各样本的AWCD进行了主成分分析(图2)和聚类分析(图3)。其中，图2显示S1与其他样本存在比较明显的分异现象，其他样本间没有明显的规律可循，即动物种类之间或笼舍垫材之间没有明显的相关性，聚类分析也得到类似的结果。

3 讨论

Biolog方法是通过微生物对多种碳底物的不同利用类型来反映微生物群落的功能多样性[5]，可以直接反映微生物群落的总体活性，在表征细菌群落动态变化的时空尺度上有显著的优势[6-7]，且具有数据量大、方便、快捷等优点，近年来被广泛应用于土壤、水体和环境等领域[8-9]。其中，生态板(ecology plate，ECO板)在土壤微生物群落功能多样性研究中应用更为广泛[4]，也用于动物的肠道微生物研究[10]，但在野生动物笼舍环境微生物的研究方面未见报道。

本研究收集的样本分别来自5种灵长动物和3种爬行动物笼舍的3种不同类型的垫材，采用Biolog-ECO板对样本的微生物活性进行分析。结果表明，15个样本的微生物活性存在极显著差异(P<0.01)。为进一步分析各样本中微生物对ECO板中不同类型碳源的利用情况，将ECO板的31种碳源分为6大类。结果，15个样本中微生物群落的差异主要表现为对碳水化合物、氨基酸、胺类3类碳源的利用上(P<0.01)，对羧酸、多聚物、酚酸类的利用差异不显著(P>0.05)，提示这些动物笼舍的环境微生物群落存在某种相似性。

将动物种类、垫材类型、日常管理均一致的来自黑猩猩笼舍的4个样本(即S6、S7、S8、S9)单独进行分析。培养96 h后的AWCD仅S6对碳水化合物的利用显著高于S9(P<0.05)，其他样本对全部31种碳源的利用，或将碳源分为6大类后进行比较，均差异不显著(P>0.05)。提示同种动物、笼舍环境相似、日常管理相同，环境微生物活性也比较一致。

将培养72、96、120 h的AWCD进行排序。发现，AWCD较高的样本主要来自垫材A，其次为垫料B，而AWCD较低的样本则主要来自垫材C。此外，来自垫材A的S1和S3的AWCD也较低。考虑到S1和S3取样时距离笼舍消毒的时间较近，推测消毒是影响环境微生物活性的重要因素，而垫材的类型相比动物种类而言，对环境微生物的影响更大，本研究中微生物活性自高到低的垫材类型依次为垫材A、垫材B、垫材C。AWCD随培养时间的变化曲线也说明笼舍内垫材类型与环境微生物活性有关，来自垫材C的样本的曲线前期斜率最大，随后迅速变缓甚至下降；而来自垫材A和垫材B的样本的AWCD曲线向上的持续性则更为明显。

对全部15个样本的AWCD进行主成分分析及聚类分析，结果S1与其他样本存在比较明显的分异现象，但其他样本之间似乎没有明显的规律可循，提示消毒对S1微生物活性产生了明显的影响。动物笼舍环境微生物的组成比较复杂，可能的影响因素较多，有待进一步研究。如，奶牛舍沙土垫料的铺垫时间、环境温度等对细菌数量都有显著影响[11]。

致谢：承蒙广东省微生物研究所李安章副研究员给予指导。