基于辣椒碱标志物的试纸条快速检测地沟油

吴 倩, 徐建国

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

地沟油主要是指从餐饮业油水分离系统或下水道中捞取油腻漂浮物,也包括一部分酸败煎炸老油、劣质动物油脂,是人们对各类废弃劣质油脂的统称[1]。地沟油由于来源复杂、精炼程度和加工工艺不同,内在组成也有显著差异,从而给检测和监管带来难题,并且精炼地沟油中很多有害物质和标记物在精炼过程中大部分已被除去,如果将少量精炼地沟油掺入其他食用油中,那么检测鉴定的难度会更大[2-3]。

我国对地沟油的检测也有大量的研究[4-9],对酸价、过氧化值、水分、碘价、羟基价这些指标进行了检测研究,但是这些指标的检测存在一定的弊端,可能会出现指标合格的地沟油和指标不合格的食用油的检测结果。北京食品安全监控中心曾发布地沟油的四大类核心指标为多环芳烃、胆固醇、电导率和特定基因组成,根据核心指标进行的检测能提高检测准确率,但是对设备、操作技术也有较高要求[10-11]。

为了有效打击和遏制利用地沟油制售食用油的犯罪行为,2011年9月以后,卫生部在全国范围内2次征集检测方法,各相关领域的研究及检测机构均积极参与其中,开展了规模空前的地沟油检测技术的研究工作,并先后验证了数百种地沟油鉴定指标和检测方法,通过辣椒碱来检测地沟油的方法通过了卫生部国家食品风险评估中心组织的多轮盲测考核,最终从281个科研院所和个人提交的315项地沟油检测方法中脱颖而出,被确定为4种地沟油检测方法之一,并向公安部、质监和工商总局等国家11部委推广使用,在多起地沟油炼制食用油案件中起到关键证据作用[12]。

根据中国的菜系及餐饮习惯,辣椒作为常用的调料在烹饪过程中加入了辣椒碱作为辣椒的有效成分能在烹饪过程中不被完全破坏并溶于油中。辣椒碱对地沟油忠贞不渝,水洗、土吸、真空、高温都无法让其分离[13]。因此将辣椒碱作为辨别地沟油的标准是检测地沟油方法的一大突破[14-15]。国内有很多研究[16-22]使用液质联用仪的方法检测辣椒碱,证明了以辣椒碱作为目标物鉴别地沟油方法的可靠性,而对于以辣椒碱为目标物的胶体金试纸条的方法研究并不多,液质联用仪的方法与胶体金试纸条的方法检测食用油中的辣椒碱相比有很多不足,前者只能在实验室检测,而且液质联用仪价格昂贵、操作难度高,耗费时间长，使该项技术难以在全国范围内普及，同时也对操作人员有较高的技术要求。之前也有关于胶体金直接鉴别地沟油的报道,但此方法的原理在于地沟油的成分复杂，容易引起胶体金的聚集从而发生颜色上的改变,对于精炼的地沟油很难引起胶体金的聚集[23]。

胶体金试纸条是以辣椒碱为目标物,利用辣椒碱很难与油脂分离的特性,即使是精炼地沟油也可以检测出来,同时在保证灵敏度的前提下,检测成本低、操作更加简便、检测时间短,非常符合现场检测的需要。

1 主要试剂与仪器

1.1 主要试剂

HAuCl4、蔗糖、柠檬酸三钠、无水甲醇、牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白(Casein)、人血清蛋白(HSA)、酪蛋白钠(Na-Casein)、磷酸缓冲溶液(PB)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)均购于国药集团化学试剂有限公司；辣椒碱抗体、辣椒碱包被原、辣椒碱标准品、羊抗鼠二抗均购于杭州贤至科技生物有限公司；硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC膜)、吸水垫、玻璃纤维膜、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板、相关试剂均购于上海捷宁科技生物有限公司；金龙鱼1∶1∶1调和油购于某大型超市。

1.2 主要仪器

加热磁力搅拌器(广州仪科实验室技术有限公司);电子天平(上海精天电子仪器有限公司);微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);移液器(芬兰雷勃公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司);美的电冰箱(美的集团);低温高速离心机(德国贺利氏公司);试纸条喷膜仪(美国伯乐公司);试纸条切条机(美国伯乐公司)。

2 实验方法

2.1 胶体金的制备

本实验所制备的胶体金采用柠檬酸三钠还原法。将250 mL的锥形瓶用王水浸泡24 h，然后自来水冲洗5 min,再将锥形瓶中装满双蒸水煮沸,重复煮沸5次后开始制备胶体金。

首先锥形瓶中加入100 mL氯金酸溶液(0.1 g/L)放到磁力搅拌器上加热至沸腾,将磁力搅拌器的转速调至1 500 r/min迅速加入一定体积的质量浓度为10 g/L的柠檬酸三钠,1 min后溶液将会发生明显的颜色变化,等溶液颜色不再发生变化后关闭热源,继续搅拌旋转5 min。将冷却后的胶体金放在2～4 ℃的条件下保存。加入不同体积的柠檬酸三钠得到胶体金的粒径大小也不同。

2.2 胶体金与抗体的偶联

取1 mL制备好的胶体金溶液,用K2CO3调节pH值并加入辣椒碱抗体振荡反应1 h后,再加入100 μL体积的10% BSA作为封闭剂,继续振荡反应0.5 h,以15 000 r/min转速离心10 min,产生红色沉淀;弃去上清液后加入0.5% Casein-Na 重悬液100 μL，复溶后均匀滴加到玻璃纤维上,放入30 ℃烘箱干燥,备用。

2.3 胶体金试纸条的制备

试纸条由样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫4个部分组成。首先将羊抗鼠二抗、辣椒碱包被原用 PB(10 mol/L,pH值 7.4)分别稀释至1 g/L,用喷膜仪包被在NC膜上,形成间隔5 mm的检测线(test line,T线)和质控线(control line,C线),C线和T线喷膜速度均为0.5 μL/cm,37 ℃条件下烘干2 h,取出置于4 ℃避光干燥保存。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上,用切条机切割成3 mm宽的试纸条保存备用。

2.4 实验参数的优化

2.4.1 不同重悬液的优化

胶体金与标记抗体偶联结束后离心加入不同的重悬液(10% BSA、10% HSA、0.5% Casein和0.5% Na-Casein),确定最适宜的重悬液条件。

2.4.2 不同封闭剂的优化

在胶体金与标记抗体偶联过程中,加入不同的封闭剂(10% BSA、10% HSA、0.5% Casein和0.5% Na-Casein),确定最适宜的封闭条件。

2.4.3 试纸条灵敏度的检测

取不同质量浓度的辣椒碱标品(0、5、10、25、50 μg/L)上样10 min后肉眼观察其显线情况。

2.4.4 试纸条特异性的检测

实验过程中,为了保证除目标检测液之外的实验条件的一致性,采取同一批组装好的试纸条、结合垫、稀释缓冲液以及上样步骤,分别对油样中容易存在的其他物质的目标液进行检测。

2.4.5 实际样品的检测

实验的实际样品为成都市食品药品检验院提供的16个油样样本,具体检测步骤如下:

(1) 取10 mL待检测的食用油油样,量取1 mL无水甲醇,加入到10 mL油样中,充分震荡涡旋混合1 min,将混合的油样通过离心机以6 000 r/min速率离心10 min。

(2) 离心完成后,吸取上层甲醇相溶液20 μL,加入到80 μL稀释缓冲液中,充分混合均匀后,取80 μL,滴加到辣椒素胶体金试纸条的加样孔内。

(3) 将温育器温度设定为37 ℃,将加样的辣椒素胶体金试纸条置于孵育器中温育10 min。

(4) 温育结束后,停止计时,对辣椒素胶体金试纸条上的显色结果进行判断。

3 结果与分析

3.1 辣椒碱试纸条的检测原理

辣椒素是引起辣味的主要化学成分,其热稳定性好、脂溶性强、沸点高,在正常使用食用油中本身不存在,且很难被目前的地沟油加工工艺完全去除。因此可以作为鉴别餐厨废弃油的特异性指标。

以辣椒素单克隆抗体标记胶体金纳米颗粒,建立竞争型免疫层析试纸法,辣椒碱胶体金试纸条结构如图1所示。若样品中含有辣椒素,辣椒素与金标抗体结合,金标抗体便不能与喷涂于T线上的辣椒素包被结合,流经C线,会与其上的二抗结合,则试纸条显示1条红线,即为阳性;若样品中不含辣椒素,金标抗体便会与T线上的辣椒素抗原结合的同时也会流经C线与二抗结合,则试纸显示2条红线,即为阴性[24-28]。

图1 辣椒碱胶体金试纸条结构

3.2 重悬液种类的选择

重悬液对于胶体金试纸条的灵敏度是极为重要的。不同的重悬液对胶体金偶联物的释放也起着关键的作用。本实验选择了4种不同的重悬液(10% BSA、10% HAS、0.5% Casein和0.5% Na-Casein)进行优化,优化结果如图2所示。从图2可以看出,0.5% Na-Casein在阴性检测线强度相同的情况下灵敏度更高,因此选择0.5% Na-Casein为胶体金偶联抗体时的重悬液。

图2 重悬液种类的优化结果

3.3 封闭剂种类的选择

封闭剂种类的选择对于胶体金试纸条的灵敏度比较重要。本实验选择了4种不同的封闭剂(10%BSA、10% HSA、0.5% Casein和0.5% Na-Casein)进行优化,结果如图3所示。

图3 封闭剂种类的优化结果

从图3可以看出,10%的BSA在阴性检测线强度相同的情况下灵敏度更高,因此选择BSA为胶体金偶联抗体时的封闭剂。

3.4 试纸条检测限和标准曲线的建立

在最佳优化条件下,对辣椒碱进行定量检测,检测结果如图4所示。

图4 辣椒碱试纸条线性检测结果

从图4a可以看出,随着样品中辣椒碱质量浓度的增加,试纸条上检测线(T线)的颜色会随之变浅,当样品中的质量浓度为10 μg/L时可以明显看出该质量浓度检测线颜色与阴性样本检测线颜色的差异,因此可以判断该样品中含有少量辣椒碱,当样品中的辣椒碱质量浓度达到50 μg/L,试纸条不再出现检测线。由图4b可知,随着样品质量浓度的增大,检测线(T线)的峰值面积越来越小,在10 μg/L处时检测线的峰面积显著减小,并且在50 μg/L峰面积基本为0,这与图4a中的检测线变化趋势保持一致,进一步说明了在辣椒碱质量浓度为10 μg/L时可以用该试纸条通过肉眼判定检测结果。由图4c可知，随着样品中的辣椒碱质量浓度的增加,检测线的峰面积逐渐减小,符合辣椒碱试纸条的检测原理。

3.5 特异性检测结果分析

为了确定该试纸条的特异性,本文选取了地沟油中可能存在的物质，分别为二噁英(Dioxin)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、苯并芘(BAP)、辣椒碱(Capsaicin)以及上述几种物质的混合样品进行检测,其中阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液(PBS),结果如图5所示。

图5 胶体金试纸条特异性检测结果

由图5a可知,只有在辣椒碱存在的情况下,辣椒碱试纸条T线会消线,只有C线存在;其余条件时T线和C线2条线均存在。图5b和图5c分别为根据图5a中T线处信号强度的峰面积得出的灰度扫描图和特异性柱状图,表明了辣椒碱试纸条具有极好的特异性。

3.6 实际样品的结果分析

实际样品的检测结果如图6所示。由图6可知,16个油样样本中编号为3、4、6、12、15号结果为阳性,其余11个样本结果为阴性,该结果证明胶体金试纸条方法可以准确鉴别出正常油样和地沟油,也进一步验证了胶体金试纸条方法的可行性与有效性。

图6 实际样品的检测结果

4 结 论

正常食用油不含辣椒碱,而地沟油主要来源于泔水油,若在烹饪过程中接触了辣味调料,尤其是牛油火锅中,则不可避免地含有辣椒碱成分。由于辣椒碱本身具有亲脂、稳定和沸点高的特性,很难从地沟油中分离出来,因此可以作为鉴别地沟油的特异性指标。

据了解,目前关于基于免疫层析试纸条检测地沟油的检测方案的报道非常少,而已有文献中将辣椒碱作为地沟油检测标记物的检测方法需要依靠大型仪器,消耗大量的人力、物力、财力,难以满足快速高效的高特异性检测要求。本文所提出的以辣椒碱为标志物的胶体金试纸条法能够有效解决以上问题,该方法达到了实际所需的灵敏度要求,检测限为10 μg/L，且在10 min之内便可以肉眼进行结果判定,为地沟油的现场检测节省大量等待时间。本文方法的建立为地沟油现场的快速检测提供了可靠便捷的技术参考。