亲环素A、基质金属蛋白酶-9在根尖肉芽肿及根尖囊肿中的表达

冯晓娜，付颖

(锦州医科大学附属第二医院，辽宁 锦州 121000)

根尖周炎是根尖周组织抵御侵入和感染牙髓的微生物及其释放产物过程破坏了根尖微生态平衡所致的疾病。由于长期激惹和机体自身防御机制不足，致使根尖周结缔组织及骨组织破坏性吸收。根尖周病的骨缺失可能是细菌及表面成分的间接作用后果[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一种酶活性中心，结合游离状态下的钙锌离子而激活以后发挥蛋白分解功能，具有高度恒定性，广泛存在于全身的结缔组织中，参加水解几乎细胞外基质的全部成分，其中也包括骨组织[2]。MMP-9是MMPs家族中的明胶酶，也称IV型胶原酶，除了可水解自然的IV、V、VII、XI胶原外，也可以水解与某些分子结合后的I、II、III型胶原明胶，还能在某种程度上降解纤维连接蛋白、弹力蛋白。骨胶原是根尖周骨组织的重要组成部分，位于骨表面的胶原层降解以后，骨的脱矿和吸收才能相继发生，MMP-9通过降解骨胶原而在骨吸收中起到了不可忽视的作用，MMP-9还可以降解细胞外基质辅助骨组织的吸收，多数研究表明MMP-9的表达量与根尖周炎的骨吸收量有关[3]。亲环素(cyclophilins，Cyps)是一类具有高度保守性的多功能蛋白家族，在真菌、细菌、植物、昆虫和哺乳动物中广泛存在。目前的研究发现亲环素有 16个成员，家族高度保守性表现为其疏水区域的氨基酸排列次序近乎相同。CyPA拥有肽脯氨酰顺反异构酶功能。CyPA可以促进丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase，MAPK)信号通路中的p38、MAPK 和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNKs)的活化[4-5]。CyPA通过与受体胞外基质金属蛋白酶诱导剂(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)结合，在类风湿关节炎、腹主动脉瘤等多种疾病中促进MMP-9表达增多活性增强。已有研究证实，CyPA的配体EMMPRIN在牙周组织成骨细胞、破骨细胞表面高表达[6]，MMP-9在破骨细胞功能的初级阶段可能已经起到一定的作用，CyPA可能通过与配体结合后，影响MMP-9的表达导致根尖周炎的发生。本实验旨在通过检测根尖周肉芽肿及根尖囊肿中CyPA及MMP-9的表达情况，从而探讨CyPA及MMP-9表达与根尖周骨吸收的联系。

1 材料和方法

1.1 临床资料

2013年10月至2015年5月在锦州医科大学附属第二医院就医的经根尖手术或牙拔除术的根尖周病损组织32例。患者年龄在18～65岁之间，平均48岁，男20例，女12例。纳入标准：(1)受试者均口腔无其他疾病；(2)无其他全身系统性疾病；(3)3个月内没有服用抗生素和或其他激素类药物；(4)非孕妇；(5)牙髓无活力，X线检查诊断为根尖肉芽肿或根尖囊肿。不符合纳入标准者，予以排除。8例因正畸需求拔除的健康前磨牙牙髓作对照组。入选患者已然明确了研究目的，自愿进行实验研究，并签署了知情同意书。本研究经锦州医科大学伦理委员会同意备案。

1.2 根尖周骨吸收面积测量

应用平行线投照技术在保持放射条件不变前提下进行X线拍摄，每次均64 kV，6.5 mA，曝光时间0.4 s，距离5 cm，进行初步鉴别。根肉芽肿X线片示围绕根尖部的圆形或椭圆形病变范围较小界线清楚的透射影。根尖囊肿X线片示患牙根尖病变范围略大透射区，边界清楚，周围有致密骨白线围绕。另一名研究者进行盲法测量，将全部X线片转换成为BMP图片格式，并应用Image-Pro plus 6.0系统测量是病变区病损骨密度值均值。

1.3 CyPA及MMP-9蛋白检测

取正常牙髓根尖1/3作为对照组，根尖手术后取出组织为实验组，常规脱水石蜡包埋切片，HE染色后组织学观察。免疫组化检测CyPA及MMP-9蛋白表达。常规切片脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，兔抗人CyPA隆抗体稀释浓度为1∶300，兔抗人MMP-9单克隆抗体稀释浓度为1∶400，于湿盒内4 ℃冰箱中孵育16～20 h，滴加二抗，于37 ℃恒温水域箱中孵育30 min，DAB染色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS替代一抗孵育切片作为阴性对照。CyPA及MMP-9 阳性表达为细胞质、细胞膜或细胞核中出现棕黄色颗粒。用倒立式荧光显微镜拍摄于400倍下随机选取5个视野，用Image-Pro plus 6.0图像处理系统计每张切片上CyPA、MMP-9的蛋白平均吸光度值(A值)。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 CyPA、MMP-9蛋白表达水平

实验组CyPA和MMP-9表达量显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2～5、表1。CyPA在实验组与对照组的组间表达中差异明显(F=73.400，P<0.05)，MMP-9在实验组表达明显高于对照组(F=33.644，P<0.05)；CyPA在根尖肉芽肿中表达多于根尖囊肿，差异具有统计学意义(P<0.05)，但MMP-9根尖肉芽肿组与根尖囊肿组并无明显差异性。

图1 正常牙髓(HE，400×)

图2 CyPA在根尖肉芽肿的表达(DAB，400×)

图3 CyPA在根尖囊肿的表达(DAB，400×)

图4 MMP-9在根尖肉芽肿的表达(DAB，400×)

图5 MMP-9在根尖囊肿的表达(DAB，400×)

表1 在根尖周炎患者与对照组患者CyPA、MMP-9

2.2 根尖周病根尖区CyPA蛋白与MMP-9蛋白的相关性分析

对于根尖周病患者根尖区CyPA蛋白与MMP-9蛋白的相关性分析，统计散点图，经统计学相关性分析，根尖周病CyPA蛋白与MMP-9蛋白平均吸光度值表达呈正相关(r=0.506，P=0.003)，在α=0.01水平上显著相关，见图6。

图6 根尖周病患者根尖区CyPA蛋白与MMP-9蛋白表达的相关性分析

2.3 CyPA、MMP-9蛋白表达与根尖周炎病损区骨密度的相关性分析

Pearson相关性分析显示CyPA蛋白吸光度值和根尖周骨密度值呈负相关关系(r=-0.410，P< 0.05)，见图7；MMP-9 蛋白吸光度值和根尖周骨密度值呈负相关关系(r=-0748，P< 0.05)，见图8。

图7 CyPA蛋白表达与根尖周骨密度的相关性分析

图8 MMP-9蛋白表达与根尖周骨密度的相关性分析

3 讨 论

根尖周炎主要是由根管感染蔓延至根尖引起的局部炎症性骨破坏疾病，此过程涉及多种细胞及其释放因子的参与，在根尖周病变中有多种细胞参与了炎症反应如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、浆细胞等，也有研究发现[7]

CyPA多表达于血管内皮细胞、淋巴细胞上，集中于血管壁并通过介导血管内皮细胞迁移和积聚使大量炎性细胞增生，继而血管重建，而毛细血管增生、淋巴细胞及单核细胞浸润是根尖肉芽肿的主要病理表现，而根尖周炎的另一重要临床表现是骨的吸收，破骨细胞是根尖周炎骨吸收的重要细胞，大量实验已经证实MMP-9是破骨细胞成熟的表面标志物之一[8]，M-CSF，RANKL可以诱导破骨细胞成熟并表达MMP-9[9]，RANK表达升高可以促进MMP-9的表达使破骨细胞活化[10]，MMP-9抑制后，破骨细胞迁移功能减弱[11]。

CyPA和MMP-9的共同作用在口腔领域研究极少，在类风湿性疾病、心血管疾病、肿瘤等领域有较多的研究。在类风湿性关节炎，细胞外CyPA与其膜受体EMMPRIN相互作用促进MMP-9的表达及巨噬细胞粘附，近而破坏软骨与骨组织[12]，表明CyPA和MMP-9的协同作用在软骨和骨的降解中起重要作用。本实验的结果与之一致，CyPA和MMP-9的蛋白表达在根尖周炎的发展中起协同作用。动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)[13]发展中CyPA可促进单核细胞分泌炎症因子IL-6，诱导单核细胞迁移趋化，CyPA通过NF-кB-MAPK炎症信号通路增强单核细胞表达的MMP-9活性，As是血管壁对各种损害过度应答引起的一系列慢性炎症过程。PCR检测喉癌中EMMPRIN及MMP-9 mRNA表达量相较于良性者明显上调，且MMP-9 mRNA的相对表达量与EMMPRIN mRNA的相对表达量均成正相关关系[14]，也提示肿瘤骨转移及骨破坏过程与三者的作用相关。在口腔专业领域，初次有学者发现了CyPA参与了牙周病的发生与发展[15]，随后国内有学者初次在根尖周炎组织中检测到了CyPA的存在[16]。

本实验中可见CyPA大量聚集于淋巴细胞、上皮细胞、血管内皮细胞，少见于巨噬细胞和浆细胞，MMP-9大量表达于主要表达在淋巴细胞、单核巨噬细胞，少见浆细胞，CyPA和MMP-9在慢性根尖周炎组织同时高表达于单核细胞，提示CyPA促进根尖周炎中MMP-9的表达，这一过程可能一方面通过CyPA通过NF-кB-MAPK炎症信号通路促进单核细胞表达MMP-9进一步发挥促炎作用，CyPA配体EMMPRIN高表达于破骨细胞表面，CyPA表达升高可能刺激根尖周组织表达TNF-α，IL-6，IL-1，IL-11而后促进RANKL的激活发挥对根尖周炎骨吸收的促进作用，RANKL，IL-1、IL-6、IL-11、TGF-α可以使MMP-9表达升高活化破骨细胞，趋化单核细胞，所以推测另一方面CyPA在与配体EMMPRIN 结合后可能通过细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1，IL-11，RANKL的作用使MMP-9协同表达，实验中MMP-9在根尖周炎组织的表达显著高于对照组，提示MMP-9在根尖周炎的发展中起到促进作用，这一作用的发挥可能是通过M-CSF，RANKL，IL-1、IL-6对MMP-9的促进使破骨细胞活化，上调中性粒细胞表达，发挥骨吸收作用。CyPA和MMP-9在根尖周肉芽及囊肿的骨吸收中所起到的协同表达可能通过单核细胞、破骨细胞发挥作用，明确调节机制仍需更多研究加以说明。临床中慢性根尖周炎症主要表现为根尖肉芽肿和根尖囊肿，临床中根尖肉芽肿可能最终发展为根尖囊肿，而两者之间的镜下的主要鉴别在于是否存在复层鳞状上皮，CyPA在上皮细胞表达提示CyPA可能对根尖肉芽肿向根尖囊肿的转化起促进作用。

综上所述，本研究中CyPA和MMP-9在根尖周炎中的表达显著高于正常牙髓组织，CyPA和MMP-9的表达与根尖区骨密度值呈负相关，两者不仅参与根尖炎症的发生过程，而且与根尖骨吸收可能密切相关。CyPA和MMP-9与全身的炎症性疾病有一定相关性，可能通过调节全身或局部的炎症反应参与了根尖周牙槽骨的破坏。