miR-206通过钙网蛋白调控乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡

孙大鹏，李晨光，张凤香

(锦州医科大学附属第一医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000)

乳腺癌是女性癌症中最常见的恶性肿瘤之一。目前主要治疗方式为手术、放疗、化疗和生物治疗，但这些治疗方法均存在着一些不足之处。近有研究证实，在乳腺癌组织中存在少量的乳腺癌干细胞，它不但具有高致瘤性和高侵袭转移性等特点，同时还具有对化疗和放疗抵抗性的特点，其在乳腺癌的发生﹑发展、转移和复发中起着十分重要的作用。因此，寻找乳腺癌干细胞的生物学标记物，研发相应的分子靶向药物，开展多位点靶向药物治疗，已成为目前乳腺癌研究的重点内容之一。

钙网蛋白(CALR)是一种多功能的钙结合分子伴侣，主要存在于内质网中。在多种肿瘤组织中改变钙网蛋白的表达水平，对不同肿瘤的发生发展起不同的调节作用[1]。研究[2]证实，在U87胶质瘤细胞中钙网蛋白的表达变化能明显影响细胞的增殖、侵袭，诱导细胞凋亡及胶质瘤组织中血管的生成。在乳腺癌MDA-MB-231干细胞中，有研究[3]显示，钙网蛋白表达上调并主要定位于胞浆内，在高侵袭性的MDA-MB-231干细胞内钙网蛋白的表达水平显著高于弱侵袭性的MCF-7干细胞。microRNAs是真核生物中广泛存在的一类长度为19～25个核苷酸的非编码RNA分子，参与调控个体发育、增殖、分化及细胞凋亡等过程[4-5]。miR-206是一个典型的多功能microRNA，位于非编码基因Bic内，在多种肿瘤细胞中均有表达。研究[6]报道，miR-206在雌激素受体α阳性的乳腺癌MDA-MB-231干细胞中表达下调；在乳腺癌MDA-MB-231干细胞中高表达的miR-206能够有效抑制细胞生长。虽然这些研究表明miR-206在乳腺癌干细胞的发生、发展过程中起到十分重要的作用，但仍不十分清楚其如何调节乳腺癌干细胞的生长。本研究主要探讨了miR-206通过干扰乳腺癌干细胞上CALR的表达来影响乳腺癌干细胞生物学活性的可能机制，进而为乳腺癌的防治提供新靶点和新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人MDA-MB-231乳腺癌细胞购自中国科学院细胞库；miR-206模拟物、抗CALR蛋白和抗N-钙粘蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，四甲基偶氮唑蓝(dimethylthiazolyl-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)购自美国Biosharp公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠 IgG购自中杉金桥有限公司，ECL发光试剂盒购自康为世纪公司，BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 乳腺癌MDA-MB-231细胞培养

胰蛋白酶消化，收获MDA-MB-231细胞，用抗人CD44-荧光素异硫氰酸酯，抗人CD24-藻红蛋白和抗人ESA-PerCP-Cy5.5-A抗体标记细胞20 min。将乳腺癌干细胞置于有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，10 μg/L表皮生长因子和2%B27的DMEM / F12(1∶1)培养基中，37 ℃，5%CO2温育下培养。

1.3 MTT法检测乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖能力

将2×103个乳腺癌MDA-MB-231细胞接种在96孔板中，用50 nM miR-206或/和Ad-CALR构建体转染，并孵育48 h。除去上清液，向各孔中加入MTT溶液，37 ℃培养3 h。吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，避光，恒温振荡器上振10 min，室温孵育20 min。放入酶标仪，以490 nm波长检测光密度(OD)值。

1.4 流式细胞术检测乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡情况

用含0.02%的EDTA和0.25%胰酶进行消化，调整细胞浓度至1×106，以冷PBS洗2次并用1×Binding Buffer重悬。取195 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后间隔3 min，再加入10 μL 或20 μg/mL的PI溶液，振荡后于室温下避光静置15 min，每管加入400 μL 1×Binding Buffer，染色后上流式细胞仪进行检测。

1.5 Western blotting实验检测乳腺癌MDA-MB-231细胞内相关蛋白的表达

用50 nM miR-206或/和Ad-CALR构建体转染，孵育48 h。RIPA裂解缓冲液分离总蛋白。将等量的蛋白质加载到8%SDS-PAGE凝胶上并转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h，然后与抗CALR(1∶500)，抗N-钙粘蛋白(1∶1000)一起温育。在TBST缓冲液后，将膜与缀合辣根过氧化物酶的第二抗体以1∶5000的浓度温育1 h。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 miR-206 mimics和/或Ad-CALR对乳腺癌MDA-MB-231细胞内CALR表达的影响

Western blotting实验检测结果显示，作用48 h后，miR-206mimics组乳腺癌MDA-MB-231细胞内CALR的表达被明显抑制(P<0.05)；miR-206 mimics+Ad-CALR组和Ad-CALR组乳腺癌MDA-MB-231细胞中CALR的表达则均被明显增强(P<0.05)，见图1。

1：空白对照组；2：Ad-CALR；3：miR-206 mimics+Ad-CALR；4：miR-206 mimics

2.2 miR-206 mimics和/或Ad-CALR对乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长影响

MTT检测结果显示，miR-206 mimics作用乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h后，细胞增殖抑制率为(52.96±3.12)%，与空白对照组比较有明显的统计学意义(P<0.05)；miR-206 mimics+Ad-CALR组和Ad-CALR组作用乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h后，细胞增殖抑制率分别为(26.64±1.78)%和(24.17±1.56)%，与空白对照组比较差异均有明显统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，miR-206可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长，但当增强CALR的表达时miR-206这种抑制MDA-MB-231细胞生长的作用被明显降低，见图2。

图2 miR-206通过下调CALR表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖

2.3 miR-206 mimics和/或Ad-CALR对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，miR-206 mimics作用MDA-MB-231细胞48 h后，细胞凋亡率为(21.96±1.72)%，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；miR-206mimics+Ad-CALR和Ad-CALR作用乳腺癌MDA-MB-231干细胞48 h后，细胞凋亡率分别为(6.93±0.41)%和(7.12±0.67)%，与空白对照组比较差异均统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，miR-206可以明显促进MDA-MB-231细胞凋亡，但当增强CALR的表达时，miR-206这种促进细胞凋亡的作用反而明显降低，见图3。

2.4 miR-206 mimics和/或Ad-CALR影响乳腺癌MDA-MB-231细胞内相关蛋白的表达

Western blotting实验检测结果显示，与空白对照组比较，miR-206 mimics组乳腺癌MDA-MB-231细胞内E-cadherin的表达被增强，而N-cadherin的表达被抑制(P<0.05)；miR-206 mimics+Ad-CALR组和Ad-CALR组乳腺癌MDA-MB-231细胞内E-cadherin的表达被明显抑制，而N-cadherin的表达被明显增强(P<0.05)。上述结果表明，miR-206可以通过增强CALR的表达来调控其EMT相关基因的表达，见图4。

A：空白对照组；B：Ad-CALR；C：miR-206 mimics+Ad-CALR；D：miR-206 mimics

1：空白对照组；2：miR-206 mimics；3：miR-206 mimics+Ad-CALR；4：Ad-CALR

3 讨 论

最近有研究证实[7-8]，在乳腺癌组织中存在少量的乳腺癌干细胞，它不但具有高致瘤性和高侵袭转移性等特点，同时还具有对化疗和放疗抵抗性的特点，其在乳腺癌的发生﹑发展、转移和复发中起着十分重要的作用。正常情况下，miR-206表达于肺癌、胃癌、乳腺癌及结肠癌等多种肿瘤细胞中。miR-206可以通过调节肿瘤细胞内不同信号通路的表达水平来影响肿瘤细胞的活性，进而调控肿瘤的形成[9-10]。在乳腺癌组织中，CALR的表达水平与肿瘤大小和转移程度正相关，CALR的表达可作为辅助的生物标记物，指导诊断、治疗并判断预后[11-13]。

本研究首先通过Western blotting检测观察乳腺癌MDA-MB-231细胞内CALR的变化情况。结果显示，miR-206 mimics显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞内CALR的表达。该研究结果表明，增强miR-206的表达可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞内CALR的表达水平。转染miR-206 mimics的乳腺癌MDA-MB-231细胞中发现细胞的凋亡明显增加，细胞的增殖能力明显被抑制。而转染Ad-CALR的乳腺癌干细胞则刚好出现相反的结果。同时共转染miR-206 mimics+ Ad-CALR后乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡数量较单独转染miR-206 mimics比较也明显下降，而乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和侵袭能力明显增强。但与单独转染 Ad-CALR比较无明显变化。上述研究结果不但证实miR-206与CALR在调节乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学活性过程中起到十分重要作用，同时还提示miR-206这种调控乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学活性的作用很可能是通过影响CALR的表达来实现的。

EMT在乳腺癌的转移和侵袭过程中起着十分重要的作用。研究[14-16]证实，许多miRNAs能够通过调控EMT的活性来影响乳腺癌的发生发展进程。本研究发现，增强miR-206的表达能够明显促进E-cadherin的表达，同时降低N-cadherin的表达，但当CALR的表达被增强时miR-206的这种作用则被逆转。上述结果说明，miR-206应该是通过影响EMT内CALR的表达来实现对乳腺癌MDA-MB-231细胞内E-cadherin和N-cadherin蛋白活性的调控。

综上所述，miR-206可能是通过抑制CALR的表达来降低乳腺癌MDA-MB-231细胞生物活性，最终阻止乳腺癌的发生发展。本研究不仅阐述了miR-206调控乳腺癌MDA-MB-231细胞内CALR表达的作用机制，而且为乳腺癌的防治提供了新靶点。