战伤后污染精子收集及纯化方法

崔 鑫，张 宁，陆 辉，于月新

北部战区总医院 生殖医学中心，辽宁 沈阳 110016

战时男性泌尿生殖系统伤害发生率高[1-2]，骨盆个人防护装备、护腹股沟合成内衣、凯夫拉板等防护装备可对泌尿生殖系统起到一定的保护作用[3]。当睾丸受到破坏性损伤时，立即从精囊或残余输精管中收集抢救精子并进行冷冻保存，复苏后用于体外受精胚胎移植，可使受伤官兵获得自己的后代[4-5]。本研究旨在探索战时泌尿生殖系统损伤后污染精子的收集及纯化方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2019年1月1日—5月1日于北部战区总医院生殖医学中心门诊就诊的500例男性志愿者为研究对象。纳入标准：禁欲2～7 d，手淫取精后精液体积≥3 ml。研究对象平均年龄(25±5)岁。所有研究对象均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 1.6%感染率污染模型制备 收集志愿者精液，随机每10份为1组。选取自然环境中土壤、砂子、树叶、污水、血液、灰尘，分别选取采样点5处，将精液与上述污染物混合备用(污染精子原液)。前期建立1.6%感染率污染模型(200例志愿者)，从0.1%庆大霉素加入精子洗液起始，根据除菌效果，逐渐升高加入的庆大霉素浓度，找到除菌效率高的加入下限后停止浓度摸索。将精液标本随机分为两组，密度梯度法组和上游法组。

1.2.2 除杂质沉淀污染精子中大量固体杂质 吸取污染精子500 μl于2 ml离心管中，将含庆大霉素的精子洗液1 000 μl缓慢加于污染精子上层，避免吹起精液层，37℃恒温箱上游30 min。

1.2.3 密度梯度法 进一步除杂质及死精子。将经过1.2.2除杂质后的上清液300 μl缓慢加入50/90密度梯度液上层，800 r/min离心15 min，吸取沉淀，计数精子密度及活力并涂板，血平板、巧克力平板37℃恒温箱培养48 h。

1.2.4 上游法 进一步除杂质及筛选出活力高的精子。吸取经密度梯度法处理后的精液沉淀，再次按照1.2.2除杂质后，吸取上清、精液层计数精子密度及活力并涂板，血平板、巧克力平板37℃恒温箱培养48 h。

1.2.5 2.0%感染率污染模型制备 1.6%感染率污染模型达到预期实验效果后建立2.0%感染率污染模型(300例志愿者)，从1.6%感染率污染模型加入庆大霉素下限起始，根据除菌效果，逐渐升高加入的庆大霉素浓度，找到除菌效率高的加入下限后停止。后续操作同1.2.2、1.2.3、1.2.4。

1.3 计数方法 吸取10 μl精子滴于精子计数板上，盖上计数板盖，显微镜下计数精子密度及精子活力(前向运动精子率、非前向运动精子率)。每份样本计数2次，取平均值。

密度回收率=处理后精子密度/处理前精子密度×100%

活力提高率=[处理后(前向运动精子率+非前向运动精子率)-处理前(前向运动精子率+非前向运动精子率)]/处理前(前向运动精子率+非前向运动精子率)×100%

2 结果

2.1 1.6%感染率污染模型除菌及精子回收结果 污染精子原液：精子密度为95.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(34.00%+10.00%)。除杂质后：血平板、巧克力平板均有菌落生长，但菌落数与污染精子原液涂板比较，有明显减少趋势；上清液中，精子密度为22.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(73.00%+18.00%)，密度回收率为23.16%，活力提高率为107.00%。密度梯度法处理后：血平板、巧克力平板均无菌落生长；沉淀中，精子密度为13.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(61.00%+22.00%)，密度回收率为13.68%，活力提高率为88.64%。上游法处理后：血平板、巧克力平板均无菌落生长；上清液中，精子密度为0.11×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(65.00%+11.00%)，密度回收率为0.12%，活力提高率为72.73%；沉淀中，精子密度为48.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(43.00%+8.00%)，密度回收率为50.53%，活力提高率为15.91%。因单纯除杂质无法抑制细菌生长，仅对密度梯度法和上游法对精子的回收情况进行比较：密度梯度法处理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法处理后上清液，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 2.0%感染率污染模型除菌及精子回收结果 污染精子原液：精子密度为96.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(38.00%+11.00%)。除杂质后：血平板、巧克力平板均有菌落生长，但菌落数与污染精子原液涂板比较，有明显减少趋势；上清液中，精子密度为21.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(50.00%+3.00%)，密度回收率为21.88%，活力提高率为8.16%。密度梯度法处理后：血平板、巧克力平板均无菌落生长；沉淀中，精子密度为17.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(45.00%+5.00%)，密度回收率为17.71%，活力提高率为2.04%。上游法处理后：血平板、巧克力平板均无菌落生长；上清液中，精子密度为0.09×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(43.00%+3.00%)，密度回收率为0.09%，活力提高率为-6.12%；沉淀中，精子密度为71.00×106个/ml，前向运动精子率+非前向运动精子率为(43.00%+1.00%)，密度回收率为73.95%，活力提高率为-10.20%。因单纯除杂质无法抑制细菌生长，仅对密度梯度法和上游法对精子的回收情况进行比较：密度梯度法处理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法处理后上清液，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

利用精子库和生殖保障车为战时男性泌尿生殖系统损伤伤员提供紧急救治，根据伤情程度采用不同方法采集并冻存精子，可为保存男性伤员生育力提供有效保障。同时，应对伤员进行心理干预，通过生育指导、辅助生殖助孕、产前诊断、随访等一系列优生优育措施，为军人提供生育保障，提高部队官兵战斗力。

目前，精子的洗涤方法主要有直接上游法、非连续密度梯度法等。Waldemar等[6]采用三次精子洗涤、病毒RNA纯化及定量聚合酶链式反应纯化人类免疫缺陷病毒感染者的精子以实施夫精人工授精干预。Andrea等[7]采用精子洗涤方法对人乳头状瘤病毒感染者进行辅助生殖技术前的精子纯化。本研究结果提示，密度梯度离心可有效去除污染精子中的污物，并保存良好的精子密度及精子活力以供辅助生殖助孕。但由于添加了抗生素，在后续的临床使用过程中，需考虑体外受精使用者对抗生素的过敏情况。本实验的技术难点在于从伤残的睾丸组织和残余的精囊或输精管中获取精子后，立即应用基层现有设备对污染精液进行污染的快速消除。本实验对抗生素种类、抗生素添加比例、密度梯度离心液种类、离心时间、上游时间等过程做了梯度认证，实验结果报告了抗菌成功及保证精子密度、活力的步骤，数据可为其他实验室提供参考。

综上所述，庆大霉素、密度梯度离心、上游等联合分离纯化污染精子可消除细菌生长，使精子具备行辅助生殖技术的密度和活力。