王迎捷 方明 黄鹂 唐立辉 陈吉华 王疆
各类树脂修复材料以及依靠树脂水门汀粘接的全瓷修复体应用日益广泛,但大量临床调查及研究均指出,修复体粘接强度不足和边缘牙体组织继发龋仍是目前导致口腔粘接修复失败的最常见的两个原因[1-2]。众多学者和牙科材料厂商围绕这两个薄弱环节进行了大量的研究并推出了多种功能性材料。
偶联剂能有效地改善界面粘接强度,同时避免机械性表面处理造成的修复体表面结构破坏、适合性降低等问题,在许多粘接修复的过程中使用偶联剂已成为共识。添加季铵盐抗菌单体的牙科修复材料,能利用其独特的接触杀菌效果持续杀灭存在于牙齿表面或进入粘接界面的细菌,是目前防治龋病最有效、最直接的途径。尽管偶联剂和季铵盐抗菌修复材料的应用能显著改善粘接效果,但口腔粘接修复步骤相对繁琐和技术敏感性强的问题仍然困扰着许多临床医生。
针对上述情况,课题组在前期研究工作的基础上,依据口腔粘接修复的特点,设计出一类兼具偶联和抗菌性能,并能够与牙科常用甲基丙烯酸酯类树脂单体聚合的有机硅季铵盐多功能分子NMOAC(其分子结构式见图1)。本研究目的在于初步评价NMOAC的偶联效果和抗菌活性,论证牙科有机硅季铵盐应用的可行性,并为进一步分子设计和性能改进提供参考。
图1 甲基丙烯酸酯改性有机硅季铵盐NMOAC的分子结构式Fig 1 Molecular structure of a methacrylate modified organosilicon quaternary ammonium salt(NMOAC)
2-(甲基(十八烷基)(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基)-λ4-氮烷基)乙基甲基丙烯酸酯氯化铵(NMOAC)、甲基丙烯酰氧基十一烷基甲基二乙氧基硅烷(DMSDIB)、甲基丙烯酰氧乙基-正十六烷基-二甲基氯化铵(DMAE-CB)、2-(甲基丙烯酞氧乙基)-正十六烷基一甲基溴化铵(MAE-HB)由空军军医大学口腔医学院研制。采用菌株变形链球菌ATCC25175、粘性放线菌ATCC15987、金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90028由空军军医大学口腔医学院检验科提供。Porcelain Primer瓷偶联剂、Biscem自粘接树脂水门汀(Bisco,USA);E-max铸瓷块(Ivoclar Vivadent,Liechtenstein);胎牛血清(杭州四季青);脑心浸液培养基(BHI,Oxoid,UK)。
1.2.1 偶联性能测试 将合成的有机硅季铵盐NMOAC和课题组前期研制的长链硅烷DMSDIB溶入99%乙醇中,加入少量去离子水和乙酸,调节pH值为4,分别配制成质量浓度为2%的两种硅烷溶液;选取成品瓷偶联剂Porcelain Primer作为标准对照。
将直径15 mm、厚4 mm的圆盘状铸瓷基底和直径6 mm、厚2 mm的圆盘状铸瓷片被粘体依次用320#、500#、1 000#水砂纸磨光,超声清洗5 min,吹干。用打孔机在聚乙烯薄膜(厚约50μm)上制备直径2 mm的圆孔,然后将聚乙烯薄膜粘在瓷基底中央以控制粘接面积与树脂水门汀厚度。根据不同偶联剂分为3组,每组20个样本。将3种偶联剂分别涂抹在相应实验组瓷基底和被粘体的粘接面,静置60 s后吹干。将Biscem树脂水门汀调拌后,涂抹于瓷基底表面的聚乙烯薄膜圆孔中,将同样经过处理的被粘体覆盖在瓷基底上,50 g砝码加压粘接,去除溢出的树脂水门汀,从各方向光照固化各40 s[3]。
剔除粘接时发生相对位移的试件,各组随机选取16个粘接样本进行37℃恒温水浴24 h,然后随机取8个粘接试样进行即刻剪切强度测试,AGS-500万能材料试验机(Shimadzu,Japan)上探头速度设定为0.5 mm/min;每组另外8个试样进行5~55℃去离子水冷热循环5 000次(1循环/min),然后进行剪切强度测试。SPSS 20.0软件(SPSS Inc.,USA)采用 one-way ANOVA及two-way ANOVA(不同偶联剂处理、冷热循环前后)分析实验结果(α=0.05)。
1.2.2 抗菌活性测试 以液体稀释法测定有机硅季铵盐NMOAC和课题组前期研制的两种季铵盐单体对4种常见口腔致病菌的抗菌活性。使用BHI液体培养基作为溶剂,配制成初始浓度为50 mg/mL溶液,连续倍比稀释配制成梯度浓度倍比稀释液各1 mL。实验菌株隔夜培养后用细菌比浊仪调整菌液浓度至1×106CFU/mL,每管含有不同浓度单体稀释液中加入菌液10μL并迅速用涡旋混合器混匀。含变形链球菌、粘性放线菌培养管置于37℃厌氧培养箱;白色念珠菌和金黄色葡萄球菌培养管置于37℃空气培养箱。培养24 h后观察试管中液体摇匀后仍清亮无混浊的抗菌剂最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。接种环挑取清亮试管中的培养物,划线接种于BHI琼脂平板上,孵育48 h,无细菌生长的最低抗菌单体浓度为该抗菌单体的最低杀菌浓度(MBC)。以上步骤重复3次。同时设立阳性和阴性对照,阳性对照不加抗菌单体只加入标化的菌悬液和等量培养基,阴性对照为不加菌悬液和抗菌单体的培养基[4]。
SPSS 20.0软件对各单体的MIC和MBC值进行方差分析以及LSD检验(α=0.05)。
经不同偶联剂处理后,瓷试件剪切粘接强度的结果详见图2。有机硅季铵盐NMOAC处理的试件,即刻粘接强度与Porcelain Primer处理组、长链硅烷DMSDIB处理组之间无显著差异(P>0.05);老化处理后各组瓷粘接强度均明显降低(P<0.05),其中NMOAC和DMSDIB处理组的老化粘接强度均显著高于Porcelain Primer处理组(P<0.05)。
图2 不同偶联剂处理后瓷粘接的即刻剪切强度与老化粘接强度(MPa)Fig 2 The immediate and aging shear bond strength between resin cement and porcelain treated with different coupling agents(MPa)
有机硅季铵盐NMOAC和2种季铵盐单体对4种口腔致病菌的MIC/MBC值见表1。NMOAC对4种口腔常见致病菌均表现出较强的抗菌活性,MIC值介于6.1~24.4μg/mL之间,作用于相同菌株时 NMOAC与课题组前期研制的两种季铵盐单体(MAE-HB和DMAE-CB)的 MIC值之间没有显著性差异(P>0.05)。
表1 不同季铵盐对4种口腔病原菌的MIC/MBC值Tab 1 MIC/MBC values of different quaternary ammonium salts against4 oral pathogenic bacterias
目前瓷贴面、嵌体等修复体粘接的临床操作仍相对繁琐,具有较强的技术敏感性,许多初学者往往因为不能完全掌握粘接修复的步骤和技术要点而导致最终修复效果大打折扣。有研究显示,熟练掌握口腔粘接技术的专业人员粘接的瓷贴面能够承受约25 MPa以上的剪切力[5],临床寿命甚至高达 20年以上[6];而缺乏粘接经验的牙科医生或实习生粘接的瓷贴面短期失败率则高达34.48%[7]。如果有一种材料能够同时行使硅烷偶联剂和季铵盐抗菌单体的功能,甚至将粘接剂的功能合而为一,那么粘接修复临床操作的步骤也将从3~4步简化为2步甚至是1步,既方便初学者掌握,又能降低操作失误的概率,对于口腔粘接修复技术的进一步推广具有重大意义。
查阅文献后,作者发现纺织品表面抗菌剂有机硅季铵盐DC-5700结构中同时具备硅氧烷基团和阳离子季铵基团这两种特征官能团[8],与牙科材料中使用的硅烷偶联剂和季铵盐抗菌单体有类似之处,但缺乏能与牙科常用树脂单体共聚的甲基丙烯酸酯基团。课题组尝试进行分子设计,以18烷基溴、2-(甲氨基)乙醇等为起始原料,通过亲核加成反应、酯化反应和季铵化反应三个核心环节,最终获得甲基丙烯酸酯改性有机硅季铵盐NMOAC。经过化学结构鉴定,证实这种分子同时具备硅氧烷基团、阳离子季铵基团和甲基丙烯酸酯基团(其MS鉴定谱见图3)。本研究的目的在于验证改性的有机硅季铵盐NMOAC是否能正常行使偶联剂和季铵盐抗菌剂的功能。
图3 有机硅季铵盐NMOAC的结构鉴定谱(MS)Fig 3 Structure identification spectrum(MS)of NMOAC
作为偶联剂使用时,即刻粘接强度测试结果显示有机硅季铵盐NMOAC溶液处理后的瓷粘接强度与商品偶联剂Porcelain Primer以及课题组前期合成的长链硅烷DMSDIB效果相当,说明NMOAC分子中的硅氧烷基团能够正常水解并与瓷表面的羟基等结构发生反应,甲基丙烯酸酯基团或疏水碳链能与树脂单体相结合,正常行使偶联功能,促进粘接强度提高。尤其值得注意的是,老化处理后NMOAC和DMSDIB处理组的瓷粘接强度均显著高于Porcelain Primer处理组P(P<0.05)。推测这是由于课题组合成的NMOAC分子与DMSDIB分子的碳链长度均比牙科常用硅烷分子γ-MPS长,根据变形层理论,硅烷偶联剂分子长度在一定范围内增加时能形成模量递减的拘束层,可以缓和界面应力[9],拉紧界面上粘接剂的结构,从而达到增韧的效果,这与课题组前期研究结果相符[10]。
抗菌活性测试结果显示甲基丙烯酸酯改性有机硅季铵盐NMOAC对4种口腔常见致病菌均表现出较强的抗菌活性。季铵盐类抗菌单体的抗菌性能与其化学结构有密切关系,其中季铵基团中疏水碳链长度的影响最为显著[11]。细菌细胞膜系统中磷脂的疏水端碳链长度为17左右,所以当季铵盐单体N端携带碳链长度在17左右时,由于其结构和磷脂相似,疏水尾更容易插入细胞膜,破坏细胞膜稳定性,造成菌体死亡。本研究中用于对照的两种季铵盐单体MAE-HB和DMAE-CB的疏水碳链长度分别为C17和C16,而有机硅季铵盐NMOAC的疏水碳链长度为C18,三者发挥抗菌作用的疏水碳链长度接近,因而表现出相似的抗菌活性。研究结果同时也证实,NMOAC中亲水的硅氧烷基团并未影响到N端疏水碳链的抗菌效能。
本研究验证了NMOAC分子的偶联效能和抗菌活性,初步证实了甲基丙烯酸酯改性的有机硅季铵盐用于牙科材料领域的可行性,为粘接修复临床操作步骤的简化提供了可能,关于其交联性能和长期稳定性仍有待进一步研究。