基于网络药理学探讨山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的作用机制Δ

关鼎鲲，杨国旺

(1.北京中医药大学研究生院，北京 100029； 2.首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科，北京 100010)

首都医科大学附属北京中医医院杨国旺主任总结个人临床上对于肺癌的治疗经验处方，从中提炼出一对化痰散结、解毒化瘀的药对——山慈菇、皂角刺，其在肺癌的治疗过程中常能够发挥控制肿瘤的作用。山慈菇味甘、微辛，性凉，归肝、脾经，功擅清热解毒、化痰散结，临床上多用以抗肿瘤，如肺癌、胃癌和肝癌等，并常以复方的形式使用[1-2]。皂角刺味辛，性温，归肝、胃经，功擅消肿托毒、排脓、杀虫，现代研究结果表明，其成分可有效抑制多种肿瘤[1，3]。中医认为，肺癌的4个基本病机为“虚、瘀、痰、毒”[4]。皂角刺有消肿解毒之功，山慈菇有解毒化痰散结之力，二者相须配伍，可以增强解毒化瘀的效果[5-6]。现代临床药物研究结果表明，山慈菇、皂角刺均有抗肺癌的作用，然而对二者抗肺癌的靶点尚不清晰，本研究意在探讨二者配伍治疗肺癌的相关靶点及通路[7-8]。网络药理学从系统生物学角度出发，观察药物对病理网络的干预和影响, 其对组合药物研究有极大帮助[9]，如已有研究探讨了左金丸对反流性食管炎的治疗[10]、葶苈大枣泻肺汤对于肺癌的治疗[11]等。因此，本研究借助网络药理学的研究方法，通过在数据库中挖掘山慈菇-皂角刺药对的化学成分、作用靶标及利用该药对与肺癌交集靶点富集相关信号通路，阐述二者配伍的治疗效果。

1 资料与方法

1.1 山慈菇、皂角刺成分筛选

以“山慈菇”“皂角刺”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索二者成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18作为活性化合物的筛选条件[12]。

1.2 药物相关靶点的获得

在TCMSP数据库中收集相关靶点信息，并将收集到的山慈菇、皂角刺蛋白靶点信息通过Uniprot数据库(https://sparql.uniprot.org/)进行蛋白与基因名称的转换，剔除重复值。

1.3 肺癌疾病靶点的获得

在人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheri-tance in man，OMIM)数据库(https://omim.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中以“lung cancer”作为关键词进行搜索，并下载相关疾病基因，进行归纳整理。

1.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络模型构建和分析

将得到的药物主要活性成分、对应基因靶点与疾病基因靶点交集录入Cytoscape 3.7.2中进行网络构建，以不同节点形状区分药物、成分、基因靶点及疾病，连线作为具有相关关系的表示。

1.5 核心靶点富集分析

将上述得到的基因靶点录入Metascape数据库(http://metascape.org)中，对其进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

2 结果

2.1 山慈菇、皂角刺有效活性成分

在TCMSP筛选出山慈菇潜在有效活性成分3种，皂角刺潜在有效活性成分12种，其成分见表1—2。二者相同有效活性成分2种，为“beta-sitosterol”(β-谷甾醇)、“Stigmasterol”(豆甾醇)。

表1 山慈菇的潜在有效活性成分Tab 1 Potentially effective active ingredients of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus

2.2 相关靶点收集

在OMIM数据库中获得相关基因靶点503个，GeneCards数据库中获得相关靶点22 399个。对GeneCards数据库获得的靶点以“Relevance score”>13.84为筛选条件，获得相关靶点1 856个。将上述2个数据库获得基因靶点合并，并剔除重复项，共获得肺癌疾病相关靶点2 232个。通过在线绘制Venn图网站Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获得药物基因靶点与肺癌疾病基因靶点的Venn图，获得交集靶点141个，见图1。

2.3 核心靶点筛选及靶蛋白相互作用网络

将收集到的交集靶点通过String数据库(https://string-db.org/)绘制肺癌与药物交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein Interaction，PPI)，见图2。将数据导入Cytoscape 3.7.2，对PPI节点的数据进行分析，图中节点面积越大代表其度值越大。以Degree(DG)>74(二倍中位数)为筛选条件筛选出核心基因靶点20个，对这20个核心基因靶点制作蛋白相互作用网络，见图3。上述20个靶点可作为山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的关键基因靶点。

图2 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的PPI图Fig 2 PPI diagram of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

图3 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的核心基因筛选图Fig 3 Core gene screening diagram of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

2.4 “药物-成分-靶点”网络模型

山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的“药物-成分-靶点”网络模型图见图4。图中，圆形节点为皂角刺、山慈菇，正八边形靶点为皂角刺、山慈菇潜在有效活性成分，正八边形A1、A2靶点为皂角刺、山慈菇相同潜在活性成分，正方形节点为皂角刺、山慈菇潜在有效活性成分对应靶点与肺癌疾病靶点交集基因；模型中，图形的面积越大，表示其相关联成分及靶点更多，其度值越大，290条边代表潜在活性成分与靶点存在的相互作用关系。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

将上述研究中得到的21个核心基因靶点输入Metascape数据库进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，按照P<0.01进行筛选。GO功能富集分析结果显示，生物分子功能方面，主要涉及一氧化氮合酶活性调节、细胞因子受体结合和转录因子结合等，见图5、表3。KEGG通路富集分析结果表明，涉及信号通路14条，主要为癌症通路、乙型肝炎通路、IL-17信号通路、膀胱癌、乳腺癌、内分泌抵抗、丙型肝炎、小细胞肺癌、VEGR通路及p53通路等，见图6、表4。

表4 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的KEGG通路富集分析前20位名称Tab 4 Top 20 KEGG function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

表3 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的GO功能富集分析前20位名称Tab 3 Top 20 GO function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

scg1为MOL007991，zjc1为MOL013179，zjc2为MOL013296；zjc3为MOL013297；zjc4为MOL001736；zjc5为MOL002914；zjc6为MOL000359；zjc7为MOL000422；zjc8为MOL000073；zjc9为MOL000098；A1为MOL000358；A2为MOL000449scg1 indicates MOL007991, zjc1 indicates MOL013179, zjc2 indicates MOL013296; zjc3 indicates MOL013297; zjc4 indicates MOL001736; zjc5 indicates MOL002914; zjc6 indicates MOL000359; zjc7 indicates MOL000422; zjc8 indicates MOL000073; zjc8 indicates MOL000073; zjc8 indicates MOL000073; zjc9 indicates MOL000098; A1 indicates MOL000358; A2 indicates MOL000449图4 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的“药物-成分-靶点”网络模型图Fig 4 Drug-component-target network of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer

图5 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的GO功能富集分析(排序前20位)Fig 5 GO function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer(Top 20)

图6 山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的KEGG通路富集分析(排序前20位)Fig 6 KEGG function analysis of gene target of drug pair of cremastrae pseudobulbus pleiones pseudobulbus and gleditsiae spina in the treatment of lung cancer(Top 20)

3 讨论

研究结果显示，山慈菇-皂角刺药对的有效活性成分槲皮素(MOL000098)、(+)-表儿茶素(MOL000073)、黄颜木素(MOL013296)、漆黄素(MOL013179)及花旗松素(MOL001736)的OB值排序居前5位，由此可以推测，上述成分可能在山慈菇-皂角刺药对治疗疾病中起主要作用。且由“药物-成分-靶点”图中可以看出，度值最高的为槲皮素，度值为113，表明其与网络中其他靶点关联最强。以往研究结果显示，槲皮素存在抑制肿瘤细胞增殖和诱导，能通过调控抑癌基因、原癌基因发挥抗肿瘤的作用[13]；漆黄素可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤[14]，可以调节由笨并(a)芘诱发的肺癌中的线粒体酶和凋亡信号[15]。由此可见，山慈菇、皂角刺相须为用有一定的药理学基础。

从PPI图中可以看出，核心基因等度值较高的基因均为与肺癌发生发展存在密切关系的基因。AKT1作为AKT的亚型[16]，与恶性肿瘤的发生发展密切相关；AKT1作为一种癌基因参与了非小细胞肺癌的发生发展过程[17]。TP53基因作为一种抑癌基因，在非小细胞肺癌中发现其突变[18]；JUN作为即刻早期基因，其包含c-JUN等原癌基因，与多种细胞因子及生长因子的转变相关，在多种恶性肿瘤中呈高表达[19]。VEGFR基因作为血管内皮生长因子受体基因，与肺癌发展中血管生成关系密切，为多种肿瘤治疗药物作用靶点；VEGFA主要通过ERK、PI3K/Akt通路诱导血管内皮细胞的增殖或存活，影响肿瘤的进展[20]。山慈菇-皂角刺药对通过上述靶点对肺癌产生作用，可能通过抑制原癌基因的表达及控制肿瘤的增殖基因，从而抑制肺癌的发生发展。

GO功能富集分析与KEGG通路富集分析结果显示，山慈菇-皂角刺药对通过多种生物进程影响肿瘤的发生发展。MAPK通路是肺癌发生发展的关键途径[21]。高水平的VEGF以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，提高血管通透性，促进肿瘤转移[22]。目前，临床上多种靶向药物通过影响EGFR信号通路治疗肺癌。山慈菇-皂角刺药对也可能通过上述通路作用于肺癌，通过抑制肿瘤分裂生长、抑制肿瘤附近血管生成以及控制肿瘤转移等途径治疗肺癌。

本研究通过网络药理学方法探讨了山慈菇-皂角刺药对治疗肺癌的可能潜在作用机制，分析其作用于肺癌的核心靶点；山慈菇-皂角刺药对可提高肺癌的治疗效果；在中医临床上可以尝试作为常规药对使用，为今后的实验室研究及临床研究提供思路。其中，VEGF等通路为本课题组的关注通路，可待日后明确其机制。