PD0721 单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

张煜彬 ， 叶路芬 ， 吴忠秀 ， 薛维娜 ， 何 彬 ，杨 畅 ， 李勇军 ， 王永林 ， 刘 亭 *

（1. 贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室， 贵州 贵阳550004；2. 贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心， 贵州 贵阳 550004；3. 贵州医科大学 医药卫生管理学院，贵州 贵阳 550025；4. 贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025）

恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康的疾病之一。 根据国家癌症中心的相关数据显示，2015 年全国新发恶性肿瘤约为392.9 万例， 男性最常见的恶性肿瘤为肺癌，女性最常见的恶性肿瘤为乳腺癌[1]。 传统恶性肿瘤的治疗手段主要为手术、化疗与放疗等多模式疗法，尽管治疗取得了进展，但由于副作用大，患者的预后不理想，长期生存也不容乐观，因此，肿瘤靶向治疗逐渐进入人们的视野[2]。

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）家族是受体酪氨酸激酶（RTK）的主要类型，是参与许多癌症进程中的血管生成、细胞分化、增殖、存活的重要信号通路[3]。EGFR 家族成员可以诱导多种信号传导途径，包括PI3K / PTEN / Akt / mTORC1，Ras /Raf / MEK / ERK 和 Jak / STAT 信号通路[4-5]。 EGFR家族成员在正常细胞生长以及恶性转化、预防细胞凋亡、抗药性、肿瘤干细胞和多种癌症的转移中发挥重要作用[6]。表皮生长因子（EGF）家族受体即表皮生长因子受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR）， 是一种相对分子质量约为170 000 的跨膜糖蛋白[7]，也称为 ErbB 或 HER 受体。 EGFR 拥有很多的突变体，其中最普通的就是EGFRvⅢ。 这种突变起源于其胞外区的外显子2-7 框内缺失， 导致841 个编码碱基对的丢失， 变为相对分子质量只有145 000 的糖蛋白，由于缺乏胞外的L1 和CR1（富含半胱氨酸）的亚结构域，因此没有被任何配体激活的能力[8]。 EGFRvⅢ作为组成型激活突变体，能够促进细胞内有丝分裂和生长支持信号传导，还能促进恶性肿瘤的发展，是肿瘤靶向治疗的理想靶点[9]。目前已经在许多人类恶性肿瘤中检测到EGFRvⅢ的存在，包括肺癌、结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、胸腺癌和头颈癌[10]。 然而，在包括正常乳腺组织在内的成人组织中， 并没有发现可检测水平EGFRvIII 的存在[11]。 目前针对 EGFR 的抗体药物有：针对非小细胞肺癌的吉非替尼，针对转移性结直肠癌和头颈癌的西妥昔单抗，针对胰腺癌的厄洛替尼以及针对乳腺癌的拉帕替尼等[12]。

单链抗体（single chain antibody fragment，scFv）是具有亲代抗体全部抗原结合活性的最小免疫球蛋白之一[13]，其相对分子质量约为30 000，由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）组成，并通过柔性多肽接头连接在一起[14]。单链抗体相对分子质量小，穿透能力强，易于在原核细胞系统内表达，是抗体偶联药物中抗体部分的优选。 本课题组前期通过单克隆技术和易错PCR 技术，得到了一株亲和力较好的抗EGFRvIII 单链抗体PD0721， 通过优化该抗体在原核中的表达条件，为制备抗体偶联药物提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

大肠杆菌 BL21 菌株、pET-22b（+）质粒、Top10大肠杆菌：均购自TaKaRa 生物技术有限公司。

1.2 实验试剂

LB 肉汤培养基、氨苄西林、异丙基硫代半乳糖、苯甲基磺酰氟、 考马斯亮蓝R-250、BCA 蛋白质质量浓度测定试剂盒、ECL Plus 超敏发光液、 兔抗His-tag 多抗、羊抗兔 IgG（H+L） HRP、牛血清白抗体：均购于北京索莱宝科技有限公司；XhoI 和NcoI酶切试剂盒：购于TaKaRa 生物技术有限公司；SDSPAGE 凝胶制备试剂盒、PCR 反应试剂盒： 均购于BBI 生命科学有限公司； 质粒DNA 抽提试剂盒：购于上海百赛生物技术股份有限公司；PCR 引物：委托TaKaRa 生物技术有限公司合成；HisTrapTMHP 亲和层析柱：购于GE 公司。

1.3 PD0721 序列的合成以及阳性克隆的筛选和鉴定

根据大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，选择优化后的PD0721 序列，使用XhoI 和NcoI 双酶切质粒 pET-22b （+）， 使用 T4 DNA 连接酶将重组PD0721 序列与 pET-22b（+）质粒片段进行连接，构建成重组质粒DNA，转化到Top10 大肠杆菌菌株中扩大培养。 按照质粒DNA 提取试剂盒抽提质粒DNA， 并转化到大肠杆菌BL21 中， 接种于含100 μg/mL 氨苄西林的LB 固体培养基上，37 ℃恒温培养12 h， 挑取阳性克隆， 设计PCR 引物进行菌落PCR 进行鉴定，引物设计见表1。

表1 引物Table 1 Primer

1.4 重组PD0721 蛋白的表达

挑取阳性克隆，接种至含100 μg/mL 氨苄西林的 LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养过夜。 以1∶100 接种到含 100 μg/mL 氨苄霉素的 LB 液体培养基中扩大培养，保持 37 ℃、180 r/min，待 OD600为0.6 左右时，加入 0.6 μmol/L 的诱导剂 IPTG，低温诱导培养12 h 表达蛋白质（15 ℃），低温离心收集菌体并破碎，取上清液，使用SDS-PAGE 电泳检测表达情况。

1.5 优化大肠杆菌BL21 表达重组PD0721 蛋白的条件

1.5.1 诱导剂IPTG 浓度对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中表达的影响 以1∶100 比例将已经活化的重组菌接种至含100 μg/mL 氨苄西林的LB培养基中，保持 37 ℃、180 r/min，待至 OD600为 0.6左右时，在摇菌管加入诱导剂IPTG，使其终浓度分别为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L，低温（15 ℃）诱导培养12 h。 低温高速离心收集菌体，PBS 清洗两次。 超声破碎菌体并收集上清液。 使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度，保持蛋白质质量浓度一致的情况下，使用10 g/dL SDS-PAGE电泳进行检测。

1.5.2 温度对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21中表达的影响 以1∶100 比例将已经活化的重组菌接种至 50 mL 含 100 μg/mL 氨苄西林的 LB 培养基中，保持 37 ℃、180 r/min，待至 OD600为 0.6 左右时，在摇菌管中加入0.6 μmol/L 的IPTG， 分别置于5、8、10、15、22、33 ℃环境中，180 r/min 诱导培养。低温高速离心收集菌体，PBS 清洗两次，超声破碎菌体并收集上清液。使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度，保持蛋白质质量浓度一致的情况下，使用10 g/dL SDS-PAGE 电泳进行检测。

1.5.3 诱导时间对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中表达的影响 以1∶100 比例将已经活化的重组菌接种至含100 μg/mL 氨苄西林的LB 培养基中，保持 37 ℃、180 r/min，待 OD600为 0.6 左右时，在摇菌管中加入0.6 μmol/L 的IPTG，分别低温诱导培养 30、24、18、12、6 h（15 ℃）。 低温高速离心收集菌体，PBS 清洗两次，超声破碎菌体并收集上清液。 使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度，保持蛋白质质量浓度一致的情况下，使用10 g/dL SDS-PAGE 电泳进行检测。

1.5.4 菌体浓度对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中表达的影响 以1∶100 比例将已经活化的重组菌接种至50 mL 含100 μg/mL 氨苄西林的LB培养基中，保持 37 ℃、180 r/min，待至 OD600分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 左右时， 在摇菌管中加入 0.6 μmol/L 的 IPTG，低温诱导培养 12 h（15 ℃）。低温高速离心收集菌体，PBS 清洗两次，超声破碎菌体并收集上清液。使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度， 保持蛋白质质量浓度一致的情况下，使用10 g/dL SDS-PAGE 电泳进行检测。

1.6 重组PD0721 蛋白的纯化

根据1.5 中重组蛋白的优化条件， 进行重组PD0721 蛋白的诱导表达。 低温高速离心收集菌体，PBS 清洗两次，加入 100 mmol/L PMSF 和 Buffer A，用高压均质机对细菌进行破碎，低温高速离心收集上清液，过0.45 μm 滤膜。 使用镍亲和柱对目的蛋白质进行亲和层析， 使用咪唑（5、10、20、50、100、150、200、500 mmol/L）进行洗脱，收集洗脱峰。 使用10 g/dL SDS-PAGE 电泳进行检测。

1.7 重组PD0721 蛋白的Western Blotting 鉴定

纯化后的重组PD0721 蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳后，电转移至PVDF 膜上，经过50 mg/mL BSA封闭液封闭过夜， 一抗为按1∶1 000 比例使用50 mg/mL BSA 封闭液稀释的兔抗His 标签单抗，4 ℃孵育 2 h，TBST 洗膜 5 次；二抗为按 1∶5 000 比例使用 TBST 稀释的羊抗兔 IgG （H+L） HRP，4 ℃孵育 2 h，TBST 洗膜 5 次，ECL 显色分析结果。

1.8 重组PD0721 蛋白的N 端测序

纯化后的重组PD0721 蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳后，电转移至PVDF 膜上，立春红染色15 min，脱色后剪下目的条带，送至上海生工测序。

2 结果与讨论

2.1 PD0721 序列的合成以及阳性克隆的筛选和鉴定

PD0721 的核酸序列如下：

CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCGGCGGCC TGGTGAAACCGGGCGGCAGCCTGAAACTGAGCTG CGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAAATTTGGCA TGAGCTGGGTGCGTCAGACCCCGGATAAACGTCT GGAATGGGTGGCGACCATTAGCACCGGCGGCTAT TATACCTATTATCCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTT TACCATTAGCCGTGATAACGCGAAAAACACCCTG TATCTGCAGATGAGCAGCCTGAAAAGCGAAGATA CCGCGATGTATTATTGCGCGCGTGGCTATAGCAGC ACCAAAGAATGGATGGATTATTGGGGCCAGGGCA CCATGGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCGGCGGCAG CGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGA TATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGC GCGAGCGTGGGCGATCGTGTGACCATTACCTGCC AGGCGAGCACCGATATTGATGATGATATGAACTG GTATCAGCAGAAACCGGGCAAAACCCCGAAACTG CTGATTTATGAAGGCAACAGCTTTATTCCGGGCGT GCCGAGCCGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACC GATTTTATTTTTACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGA AGATATTGCGACCTATTATTGCCAGCAGCTGCAGA GCTTTAACGTGCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACC AAAGTGGAAATTAAA

该核酸序列根据大肠杆菌密码子的偏好性进行了优化。

随机挑取9 个菌落，菌落PCR 进行琼脂糖电泳，挑取的9 个菌落都为阳性克隆菌落，结果见图1。

图1 菌落PCRFig. 1 Colony PCR

2.2 重组PD0721 蛋白的表达

阳性克隆菌株在0.6 μmol/L 的诱导剂IPTG 条件下，低温诱导培养12 h 表达蛋白质（15 ℃），低温离心收集菌体并破碎，取上清液进行SDS-PAGE 电泳检测，结果见图2。 加入诱导剂IPTG 的菌体会表达相对分子质量为31 000 左右的重组目的蛋白质，而没有加入诱导剂的情况下菌体并不会表达目的蛋白质。

图2 IPTG 诱导大肠杆菌BL21 表达重组PD0721 蛋白Fig. 2 IPTG induced E. coli BL21 express recombinant PD0721 protein

2.3 优化重组PD0721 蛋白的表达条件

2.3.1 IPTG 浓度对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中表达的影响 待菌液OD600达到0.6 左右，分别加入不同浓度的诱导剂 IPTG（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L），低温 15 ℃诱导培养 12 h。 超声破碎菌体并收集上清液，使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度后，进行SDS-PAGE 电泳检测，结果见图3。在OD600为0.6、诱导时间为12 h、诱导温度为15 ℃的情况下， 当诱导剂浓度在0.1~0.6 μmol/L 范围内时，PD0721 蛋白的表达量随着诱导剂浓度的增加而增加； 当诱导剂浓度在0.6~1.0 μmol/L 范围内时，PD0721 蛋白的表达量随着诱导剂浓度的增加而降低； 当诱导剂浓度为0.6 μmol/L时，PD0721 蛋白的表达量最大。

图 3 不同浓度 IPTG 对重组 PD0721 蛋白表达影响的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant PD0721 in different inducer IPTG concentration

2.3.2 温度对重组PD0721 蛋白表达的影响 待菌液 OD600达到 0.6 左右，加入浓度为 0.6 μmol/L 的诱导剂IPTG 后， 分别将菌液放置于不同温度（5、8、10、15、22、33 ℃）中培养 12 h。超声破碎菌体并收集上清液，使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度后，进行SDS-PAGE 电泳检测，结果见图4。在OD600为 0.6、诱导时间为12 h、诱导剂IPTG浓度为0.6 μmol/L 的情况下， 当诱导温度在15 ℃以内时，PD0721 蛋白的表达量随着诱导温度的增加而增加；当诱导温度超过15 ℃时，PD0721 蛋白的表达量随着诱导温度的增加而降低；当诱导温度为15 ℃时，PD0721 蛋白的表达量最大。

图4 不同诱导温度对重组PD0721 蛋白表达影响的SDSPAGEFig. 4 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant PD0721 at different induced temperature

2.3.3 诱导时间对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中表达的影响 待菌液OD600达到0.6 左右，加入浓度为 0.6 μmol/L 的诱导剂 IPTG 后， 分别低温（15 ℃）诱导培养 30、24、18、12、6 h。 超声破碎菌体并收集上清液，使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度后， 进行SDS-PAGE 电泳检测，结果见图 5。 在 OD600为 0.6、诱导温度为 15 ℃、诱导剂浓度为0.6 μmol/L 的情况下，当诱导时间大于12 h 时，PD0721 蛋白的表达量随着诱导时间的减少而增加；当诱导时间小于12 h 时，PD0721 蛋白的表达量有所降低；当诱导时间为12 h 时，PD0721蛋白的表达量最大。

图5 不同诱导时间对重组PD0721 蛋白表达影响的SDSPAGEFig. 5 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant PD0721 under different induction times

2.3.4 菌体浓度对重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中表达的影响 待菌液OD600分别达到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 左右， 加入浓度为 0.6 μmol/L 的诱导剂 IPTG 后，低温（15 ℃）诱导培养 12 h，超声破碎菌体并收集上清液。使用BCA 蛋白质质量浓度试剂盒测定蛋白质质量浓度后，进行SDS-PAGE 电泳检测，结果见图6。 在诱导时间为12 h、诱导温度为15 ℃、诱导剂浓度为 0.6 μmol/L 的情况下，当 OD600小于0.6 时，PD0721 蛋白的表达量随着菌体浓度的增加而增加；当OD600大于0.6 时，PD0721 蛋白的表达量有所降低；当菌液OD600约为0.6 时，PD0721 蛋白的表达量最大。

图6 不同菌体浓度对重组PD0721 蛋白表达影响的SDSPAGEFig. 6 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant PD0721 with different bacterium densities

2.4 重组PD0721 蛋白的纯化

目的蛋白质末端携带了6 个组氨酸标签，可以使用Ni2+柱进行纯化。在15 ℃和0.6 μmol/L 诱导剂IPTG 的条件下进行蛋白质表达。 收集并裂解菌体，裂解液离心过滤后，进行Ni2+柱亲和层析。考察不同浓度的咪唑（5、10、20、50、100、150、200、500 mmol/L）的洗脱效果，获得最佳的纯化方案，结果见图7。 经过Ni2+柱亲和层析后， 当咪唑的浓度为150 mmol/L时，能够得到纯度较高的PD0721 蛋白。

图7 纯化后重组PD0721 蛋白的SDS-PAGE 分析Fig. 7 SDS -PAGE analysis of recombinant PD0721 protein after purification

2.5 重组PD0721 蛋白的Western Blotting 鉴定

纯化后的样品经过Western Blotting 电泳后，结果见图8。 在31 000 附近观察到可见特异条带，相对分子质量与重组PD0721 蛋白基本相同， 表明重组PD0721 蛋白在大肠杆菌BL21 中成功表达。

图8 纯化后重组PD0721 蛋白的Western Blotting 鉴定Fig. 8 Western Blotting analysis of purified recombinant PD0721 protein

2.6 重组PD0721 蛋白的N 端测序

利用 Edman 降解法将重组 PD0721 蛋白 N 端的氨基酸依次水解， 借助高效液相色谱分析其序列， 结果见图9-10。 样品的N 端序列为Met-Gln-Val-Gln-Leu（简写 MQVQL）与重组 PD0721 蛋白的序列一致，结合Western Blotting 的实验结果，表明纯化的蛋白质为重组PD0721 蛋白。

图9 重组PD0721 蛋白的N 端氨基酸序列分析图Fig. 9 N-terminatio amino acid sequencing map of recombinant PD0721 protein

3 结 语

原核表达中的目的蛋白质经常发生错误的折叠，且原核本身就没有翻译后修饰的环节，比较容易形成包涵体，可以采用降低诱导温度或降低IPTG浓度并延长诱导时间来改善； 该质粒为分泌型表达，将蛋白质输出到细胞周质中。

图10 N 端测序序列与重组PD0721 蛋白序列比对Fig. 10 Sequence alignment of N end sequencing and recombinant PD0721 protein sequencing

通过将转化重组质粒的大肠杆菌在不同诱导剂浓度下培养， 发现诱导剂浓度为0.6 μmol/L 时，PD0721 蛋白的表达量最大；诱导剂IPTG 的作用是激活乳糖操纵子， 使细菌开始合成外源蛋白质，但当诱导剂浓度过高时，细菌合成的外源蛋白质更容易形成包涵体，导致可溶性降低，含量减少[15]。 诱导温度为l5 ℃时，目的蛋白质的表达量最多；诱导温度低时，热休克蛋白未被激活，其对蛋白质的降解作用就比较弱， 有助于形成蛋白质的活性空间结构；但如果温度过低，促进蛋白质折叠的伴侣蛋白质活性被抑制，反而降低了可溶性蛋白质的表达量[16]；温度过高时，大肠杆菌则开始增殖，不利于表达蛋白质。 当诱导时间为12 h 时，重组目的蛋白质表达量最大；可溶性蛋白质的表达量随着时间的增加先增加后减少，表明诱导时间过长可能导致可溶性蛋白质变性为包涵体蛋白质，过长的诱导时间反而不利于可溶性蛋白质的获得[17]。 菌液OD600约为0.6 时，PD0721 蛋白的表达量最大；菌液浓度过低，菌体尚处于迟缓期， 加入IPTG 诱导剂将会对还未适应新环境的菌体产生一定的影响；若菌液浓度过高，菌体开始进入稳定期，菌体繁殖速度开始下降，培养基内毒性产物开始增多，不利于重组蛋白质的积累。 作者优化了诱导重组PD0721 蛋白表达的诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间以及菌体浓度等几个重要条件，为后续获得更多的重组目的蛋白质打下了坚实的基础。

在后续的蛋白质纯化实验中，选择裂解菌体之后的上清液用于纯化， 是由于重组PD0721 蛋白属于可溶性蛋白质，而沉淀中的蛋白质大多数是以包涵体的形式存在的，没有生物活性与功能。 上清液中的目的蛋白质经过镍柱亲和层析纯化之后使用SDS-PAGE 分析、Western Blotting 鉴定以及蛋白质的N 端测序鉴定，可确认为目的蛋白质，为后续研究重组PD0721 蛋白与细胞毒性药物偶联提供了一定的基础。