稳定脑肥大细胞减轻脂多糖诱导的肝脏炎症

朱 友，董洪权，李梦羽，张 姝，周希乔*

1南京医科大学第一附属医院消化科，江苏 南京 210029；2中大医院江北院区消化内科，江苏 南京 210044；3南京医科大学第一附属医院麻醉科，4临床医学研究院，江苏 南京 210029

大量研究表明，中枢对外周器官的调控可以通过各种神经肽、神经激素和神经递质实现，其中下丘脑-垂体-靶腺轴在调节外周的能量代谢、生长发育中发挥重要作用［1］。肝脏是糖、氨基酸、脂质和胆固醇等营养素代谢中心，也参与维持免疫系统平衡，是许多生理病理过程的关键枢纽，在消化系统中具有重要地位［2］。近年来，中枢神经系统在肝脏调节代谢中的作用引起了越来越多的关注［3］。机体的代谢状态与甲状腺激素水平息息相关，甲状腺激素通过靶基因的转录调控来实现肝脏脂质及能量稳态的调节［4］。

肥大细胞在中枢神经系统中普遍存在，主要位于丘脑-下丘脑区［5］，通过分泌大量血管活性物质、细胞因子和蛋白酶等参与过敏和局部炎症反应［6］，可能在神经免疫反应中发挥作用［7］。尽管有研究发现中枢神经系统和炎性肝脏疾病具有相关性［8］，但神经系统内的特异性细胞群在肝脏炎症中的作用研究甚少。因此，本研究旨在阐述脑内的肥大细胞在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肝脏炎症中的调节作用，并探讨这种调节作用是否与下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamic-pituitary-thyroid，HPT）轴有关。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（220～250 g），购自南京医科大学医药实验动物中心。在标准实验室条件下［温度（25±2）℃，相对湿度（60±10）%，室内换气12～18 次/h，室内光/暗循环12 h］饲养，每笼5 只。适应1周后开始本研究，并按照正常的饮食和水随意喂养。本研究由南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准（IACUC-2104041），所有实验均按照中华人民共和国国家科学技术委员会制定的《实验动物管理条例》进行。LPS、色甘酸钠均购自美国Sigma 公司。BCA 蛋白检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。兔多克隆NF-κB 抗体、c-JNK抗体、p-JNK抗体、p38抗体、p-p38抗体、ERK抗体、p-ERK抗体、AKT抗体、p-AKT抗体、Lamin B抗体及兔单克隆GAPDH 抗体、羊抗兔二抗均购于美国Cell Signaling 公司。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）和甲状腺素（thyroxine，T4）ELISA试剂盒购于美国R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模和给药

将大鼠随机分为5组，分别为对照组（Ctr）、LPS造模30 min 组（LPS 30 min）、LPS 造模24 h 组（LPS 24 h）、色甘酸钠+LPS 30 min组（cro+LPS 30 min）、色甘酸钠+LPS 24 h组（cro+LPS 24 h），每组12只。

由于脑内肥大细胞富集于下丘脑区域，肥大细胞稳定剂色甘酸钠脑立体定位给药于单侧下丘脑区域。大鼠经戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，被固定在脑立体定位仪（Stoelting Instruments 公司，美国）中，并使用加热垫保持在37 ℃。给药套管定位在右侧下丘脑中，位置如下［9］：前囟右1.80 mm，前囟后1.90 mm，前囟下深8 mm，倾斜角度为10°。手术后，待动物自然清醒分笼饲养，每天对动物进行套管检查。14 d 后，色甘酸钠组大鼠经套管给予2 μL 色甘酸钠（100 μg/μL）预处理。其余组大鼠用2 μL 无菌生理盐水预处理。预处理30 min后，4组实验组大鼠腹腔注射LPS（1 mg/kg），而对照组注入无菌生理盐水。LPS注射30 min或24 h后，用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后处死。收集大鼠大脑、肝脏和血液样本，所有样本均按要求储存。

1.2.2 酶联免疫吸附实验

采用ELISA 方法测定TNF-α、IL-6、TSH、T3 和T4，按试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 病理组织学检查

用常规方法将10%福尔马林固定石蜡包埋的肝组织切片分为4 μm切片，用盖玻片固定于载玻片上。根据标准方案，用苏木精和伊红（HE）对每个固定肝脏的代表性切片进行染色。利用Leica DM2500显微镜和图像分析显微系统对切片进行观察。由同一位有经验的组织病理学家以盲法提供所有的组织学分析。

1.2.4 蛋白免疫印迹分析

100 mg肝脏标本在200 μL RIPA裂解缓冲液中匀浆，置于冰上保存30 min，然后在4 ℃，12 000g离心15 min。采用BCA 蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白含量。蛋白质（60 μg）用样品缓冲液变性，SDS-PAGE电泳分离，将分离的蛋白转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗在4 ℃下孵化过夜，然后加入抗兔二抗孵育1 h，用增强化学发光试剂盒显影蛋白条带。每个免疫印迹实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计分析。数据以均值±标准误（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 色甘酸钠抑制LPS诱导的肝细胞损伤

LPS可以同时引起中枢和外周的应激反应［10］。本研究发现，外周给予LPS后，可以诱导肝脏细胞的损伤。如图1 所示，对照组肝脏切片显示正常的小叶结构和细胞结构。LPS（1 mg/kg）腹腔注射后30 min和1 h，肝脏切片显示明显的病理变化，表现为细胞肿胀、局灶性坏死、纤维化和炎症细胞浸润，以及有广泛的门静脉炎症出现。但预先给予肥大细胞稳定剂色甘酸钠预处理后再注入LPS，肝脏的病变明显减弱，表现为细胞肿胀、局灶性坏死、纤维化和门静脉炎症区域减少。这一结果表明，脑室内给予肥大细胞稳定剂色甘酸钠阻断脑肥大细胞的脱颗粒，可减轻LPS诱导的大鼠肝脏炎症。

图1 色甘酸钠对LPS诱导的肝脏组织病理改变的影响（HE，×200）Figure 1 Effects of cromolyn on LPS-induced liver histopathological changes（HE，×200）

2.2 色甘酸钠可以降低LPS诱导的TNF-α和IL-6水平

ELISA法测定血清和肝组织中TNF-α和IL-6水平。如图2A 所示，与对照组相比，LPS 处理30 min后血清TNF-α和IL-6水平显著升高（P＜0.01），24 h时下降，但仍高于对照组（P＜0.05）。然而，色甘酸钠预处理30 min显著降低了LPS诱导的TNF-α和IL-6 分泌增加（P＜0.05）。进一步检测肝标本中TNFα和IL-6水平，如图2B所示，在LPS注射后30 min和24 h，大鼠肝脏中的TNF-α和IL-6水平显著升高（P＜0.01）。色甘酸钠预处理30 min 减轻了LPS 作用30 min诱导的TNF-α产生（P＜0.05）及LPS作用24 h诱导的肝脏TNF-α和IL-6水平的升高（P＜0.01）。

图2 色甘酸钠降低LPS诱导的TNF-α和IL-6水平Figure 2 Cromolyn reduced TNF-α and IL-6 levels induced by LPS

2.3 色甘酸钠缓解LPS 诱导的大鼠HPT 轴激素水平的改变

我们推测肥大细胞稳定剂色甘酸钠减轻肝脏炎症的作用可能与甲状腺激素水平有关。ELISA法测定血清和下丘脑标本中TSH、T3、T4 水平。如图3A 所示，与对照组相比，腹腔注射LPS（1 mg/kg）后30 min或24 h显著降低血清TSH水平（与对照组相比，分别降低了34.46%或41.61%，P＜0.01）和T3水平（与对照组相比，分别降低了31.48%或38.17%，P＜0.05）；LPS 作用30 min 有增加血清中T4水平的趋势，但无显著性差异（与对照组相比，增加了21.77%），LPS 作用24 h 显著增加血清中T4 水平（与对照组相比，增加了24.29%，P＜0.05）。然而，色甘酸钠（200 μg）可以缓解LPS 作用24 h 引起的血清中TSH 和T3 水平降低，以及T4 水平升高（P＜0.05）。但只能缓解LPS 作用30 min 引起的TSH 升高，对T3 和T4 水平无显著影响；如图3B 所示，腹腔注射LPS（1 mg/kg）后30 min 显著降低了下丘脑中TSH 水平（与对照组相比，降低了18.63%，P＜0.05），但是LPS 作用24 h 对下丘脑中TSH 有抑制作用但无显著性差异（与对照组相比，降低了22.25%）。LPS作用30 min对下丘脑T3水平无显著影响（与对照组相比，降低了8.24%），但LPS作用24 h显著抑制下丘脑T3 水平（与对照组相比，降低了26.82%，P＜0.05）。LPS 作用30 min 和24 h 均显著增加下丘脑中T4 的水平（与对照组相比，分别增加了46.93%或32.45%，P＜0.05）。色甘酸钠可以缓解LPS作用30 min诱导的下丘脑中TSH水平的减少和部分缓解T4 水平的增高（P＜0.05）。同时色甘酸钠可以缓解LPS 作用24 h 引起的下丘脑中T3 水平的下降和T4 水平的增高（P＜0.05）。这些结果表明，脑内肥大细胞可能通过HPT 轴对肝脏炎症进行调节。

图3 色甘酸钠对HPT轴功能的影响Figure 3 Effects of cromolyn on the hypothalamic-pituitary-thyroid axis

2.4 色甘酸钠抑制LPS 诱导的肝脏AKT、MAPK 和NF-κB信号通路的激活

NF-κB是一种主导炎症的转录因子，一旦激活，NF-κB 发生核转位，调节细胞因子介导的炎症反应［11］。我们检测了色甘酸钠对NF-κB激活的影响。与对照组相比，实验组大鼠LPS 腹腔注射30 min 和24 h后，肝组织细胞核中NF-κB表达显著增加，但均可以被色甘酸钠所抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。AKT 和MAPK 是主要的信号转导的通路效应因子，负责促炎因子的合成和产生，MAPK主要包括以下家族成员：细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）和p38MAPK［12］。LPS 处理可导致肝内AKT、p38 和ERK 的快速磷酸化。与对照组相比，在LPS 注射后30 min 和24 h，AKT、p38 和ERK 均被激活发生磷酸化。然而，JNK仅在LPS 注射后30 min 发生磷酸化（P＜0.05，图4）。色甘酸钠预处理显著抑制了肝脏中LPS 作用30 min 和24 h 时引起的MAPK 活化。这些结果表明，色甘酸钠可以抑制LPS 诱导的MAPK、AKT 和NF-κB肝脏信号通路的激活。

图4 色甘酸钠抑制LPS诱导的MAPK信号通路和NF-κB活化Figure 4 Cromolyn inhibits LPS induced MAPK signaling pathway and NF-κB activation

3 讨论

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化及肝癌，已成为严重威胁人类健康的全球性疾病，是美国肝移植的第一大原因，现也超越病毒性肝炎成为我国慢性肝损伤的第一大原因。LPS 作为细菌代谢的主要产物，通过肠肝循环经门静脉进入肝脏，导致TNF-α和IL-6 等炎症因子生成增加，进而引起肝细胞损伤、变性、凋亡，参与NAFLD 的发生发展［13-15］。本研究也证实了腹腔注射LPS 可以引起肝脏炎症，以及血清和肝脏组织中炎性因子水平的增高。

我们前期研究发现，腹腔注射LPS 可以诱导大鼠下丘脑的肥大细胞激活，而肥大细胞稳定剂可以抑制这种激活［16］。在本研究中我们也发现下丘脑定位给予肥大细胞稳定剂色甘酸钠可以抑制LPS引起的外周血和肝脏中炎性因子水平的上升。由于血脑屏障的存在，脑定位给予的色甘酸钠无法影响到肝脏中的肥大细胞，因此色甘酸钠肝脏炎症的这种抑制作用，来自于稳定脑内肥大细胞。我们还发现色甘酸钠作用30 min和24 h均可以抑制LPS引起的炎性因子生成，说明脑内肥大细胞对于肝脏炎症的作用是快速且持续的。本研究结果表明，脑内肥大细胞在调节肝脏炎症中发挥了作用。

大量研究证实LPS可以诱导下丘脑和垂体激素发生代谢改变［17-18］。但是恢复下丘脑和垂体激素水平是否能缓解LPS诱导的肝脏炎症尚不清楚。甲状腺激素的释放受HPT轴的严密监督，甲状腺激素与炎症之间的相互联系［19］，尽管已广为人知，但尚未得到充分研究。本实验发现在LPS引起的肝脏炎症过程中，血清和下丘脑中TSH和T3激素水平显著下降而T4水平显著升高，这表明LPS诱导了脑神经递质改变和HPT 轴的激活。富含肥大细胞的下丘脑区是HPT轴的核心区域。本研究还发现，下丘脑内给予肥大细胞稳定剂色甘酸钠可以恢复LPS诱导的激素水平改变，并抑制LPS 诱导的肝脏炎症。说明中枢神经系统中肥大细胞对肝脏炎症的调节作用可能是通过HPT轴实现的。

NF-κB信号通路参与了炎症反应［20］。一旦激活，NF-κB进入细胞核，调节炎性细胞因子的表达［21］。本研究发现，色甘酸钠抑制LPS 诱导的肝脏NF-κB 激活。AKT和MAPK通路也参与了LPS诱导的炎症反应，我们进一步评估了色甘酸钠对AKT和MAPK信号通路的影响，发现色甘酸钠抑制了LPS 诱导的肝脏中AKT 和MAPK 的激活。这进一步说明中枢神经系统肥大细胞在调节肝脏炎症促炎因子信号通路中发挥作用，是否涉及其他促炎因子及信号通路，尚待后续的实验深入研究。

综上所述，本研究表明脂多糖可引起肝脏炎症，稳定脑内肥大细胞可能通过HPT轴抑制脂多糖诱导的肝脏炎症。因此，进一步深入研究中枢神经系统肥大细胞激活在肝脏炎症中的作用机制，将为肝脏炎症相关性疾病的预防和治疗提供新的思路。本研究的创新点在于将肝脏炎性的调节与下丘脑中肥大细胞的激活相联系，中枢神经系统对肝脏炎症的调节作用为治疗炎症性肝病拓展了治疗思路。