烟草赤星病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

谢中玉，王晓强，沈 宏，孙光军，李 斌，崔志燕，，张永峰，冉 茂，陈海涛，张 帅，汪代斌，陈德鑫*，孙现超

1.西南大学植物保护学院，重庆市北碚区天生路2号 400716 2.中国农业科学院烟草科学研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11号 266101 3.中国烟草总公司贵州省公司，贵阳市云岩区瑞金北路146号 550000 4.中国烟草总公司四川省公司，成都市武侯区世纪城路936号 610000 5.陕西省烟草公司商洛市公司，陕西省商洛市商州区北新街155号 726000 6.重庆烟草科学研究所，重庆市北碚区天生路2号 400715 7.重庆市烟草公司酉阳分公司，重庆市酉阳土家族苗族自治县桃花源中路99号 409800

烟草赤星病是由链格孢菌（Alternaria alternata）引起的叶斑类病害，一般在烟株成熟后期发病较严重，在世界各产烟区均有发生，对烟叶产量和品质造成了较大影响。赤星病的发病和烟叶成熟衰老程度密切相关，随着烟叶成熟度的增加，烟叶抗病性下降，一旦病害发生就会给烟叶生产带来较大损失［1]。烟草赤星病的田间病症及往年发病规律是诊断该病害的主要依据。在病害症状显现之前，感染烟草链格孢菌的较幼嫩的烟草植株叶部不表现症状或只表现出轻微症状，此时无法判断病原菌的种类，也无法对症下药进行防治，极易错过最佳的防治时期，不利于该病害的控制［2-4]。因此，对烟草赤星病的定量检测，确定病害发病的最低病原菌量，实现分子快速检测预警具有重要意义。

针对烟草赤星病菌的检测技术方法已有较多报道，如常规组织分离方法、血清学酶联免疫吸附法和基于PCR的聚合酶链式反应等［5]。唐承成等［6]通过分子生物学鉴定及柯赫氏法则，鉴定出2种不同的病原菌，一个为链格孢菌（A.alternata），另一个为长柄链格孢菌（Alternaria longipes）。组艳青等［7]通过分离病原菌并进行致病性测定、形态学鉴定及rDNA-ITS序列分子鉴定，发现1个烟草赤星病的致病新种为鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）。然而这些常规的分子生物学方法操作过程较繁琐，需要分离培养病原菌并进行后续的普通PCR检测鉴定。而目前的q-PCR不仅可以大大简化实验步骤，而且可以提高检测的灵敏度和有效性，从而实现病菌的定量分析。同普通PCR、巢式PCR相比，q-PCR具有更加快速、灵敏、简便等优点［8-9]。q-PCR既可以进行定性分析又可定量分析，且无须在扩增后进行一些常规操作，如电泳检测，大大降低了污染的可能性，同时提高了检测的准确性［10]。利用q-PCR的方法对病原菌进行快速检测已有较多报道。杜清春等［11]建立了基于q-PCR方法的炭疽杆菌快速检测体系。张海燕等［12]通过q-PCR对土壤中的茄科雷尔氏菌进行检测并已实际应用。余鹏举等［13]建立了SYBR Green I q-PCR方法用于检测核桃感病组织内胶胞炭疽菌。Guo等［14]在保守性好的tubB基因序列基础上设计了针对谷物根瘤菌（Rhizoctonia cerealis）的特异性引物，并成功构建出q-PCR检测体系，不但可以快速发现存在的病菌，还可以确定病原菌的积累量，为确定病害的防治时期提供了依据。但目前q-PCR检测在烟草叶片病害上的研究报道还较少，特别是在烟草赤星病上尚鲜见报道，因此针对烟草赤星病菌设计了1对特异性引物，对其特异性和灵敏度进行验证，同时建立一种高效快速的q-PCR检测体系，以期为该病害的有效防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试病原菌：烟草赤星病菌（Alternaria alternata），烟草黑胫病菌［Phytophthora parasiticavar.nicotianae（Breda de hean）Tuker]、烟草棒孢霉菌（CorynesporaGüssow）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、花生镰刀病菌（Fusarium roseum）、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum schw）、棉花枯萎病菌［Fusarium oxysporumSchl.f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder&Hansen]均由中国农业科学院烟草研究所病害实验室保存。

1.1.2 试剂

十六烷基三甲基溴化铵（2×CTAB）、2%（质量体积分数）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和25 mmol/L EDTA（北京博远泰隆生物科技有限公司），2.0 mol/L NaCl（国药集团化学试剂有限公司），100 mmol/L Tris-HCl（北京索莱宝科技有限公司）。V（酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）=25∶24∶1、醋酸钠、异丙醇、10×PCR Buffer、dNTPS和Taq DNA（北京索莱宝科技有限公司），SYBR Green I（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。

1.1.3 仪器

Q5000超微量核酸蛋白测定仪（美国QUAWELL公司）；Ge-neAmp PCR Syetem 9700基因扩增仪、ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）；DYY-12型电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌DNA的提取

采用CTAB法提取病原菌总DNA，根据陈锋菊等［15]、Tendulkar等［16]的方法稍做改动。①取1～2 g病原菌菌丝在液氮中快速研磨，加入1 mL CTAB裂解1 h，于4℃条件下12 000 r/min离心15 min；②吸取上清液800µL，加入等体积的V（酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）溶液抽提2次，颠倒混匀，于4℃条件下12 000 r/min离心15 min；③取上清液600µL，先在离心管中加入1/10体积的醋酸钠，再加入上清液，最后加入2/3体积的异丙醇，于-20℃放置40 min；④于4℃条件下12 000 r/min离心15 min，去掉上清液，沉淀物用80%的乙醇洗涤两次，12 000 r/min离心1 min，加入30～50µL ddH2O溶解沉淀。提取的DNA用Q5000超微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度，并置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 引物的设计

根据NCBI GenBank中的烟草链格孢菌的ITS基因序列，利用Primer5软件设计引物，共5对，其中获得对烟草赤星病菌具有特异性的一对引物AS1F（5′-TGCAATCAGCGTCAGTAACAAAT-3′）和AS2R（5′-ATGGATGCTAGACCTTTGCTGAT-3′）。

1.2.3 常规PCR特异性及灵敏度检测

以烟草赤星病菌（A.alternata）标准菌株为模板，烟草黑胫病菌（P.parasiticavar.Nicotianae）、烟草棒孢霉菌（C.Güssow）、葡萄炭疽病菌（C.gloeosporioides）、黄瓜枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、花生镰刀病菌（F.roseum）、番茄晚疫病菌（P.infestans）、棉花枯萎病菌（F.oxysporumSchl.f.sp.vasinfectum）、小麦赤霉病菌（F.graminearum schw）为阴性对照，ddH2O为空白对照，用引物AS1F/AS2R进行普通PCR扩增，检测引物特异性。

用超微量核酸蛋白测定仪检测烟草赤星病菌基因组DNA的浓度，稀释至100 ng/µL，然后按10倍梯度进行稀释，先取10µL浓度为100 ng/µL的DNA加入到90µL ddH2O中，将DNA浓度稀释成1×10 ng/µL，然后取10µL浓度为1×10 ng/µL的DNA加入到90µL ddH2O中，即为1×1 ng/µL，依次类推稀释为1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6ng/µL，以ddH2O为空白对照，每个浓度梯度取1.0µL进行普通PCR灵敏度的检测。25µL常规PCR扩增体系：模板DNA 1µL，上下游引物各1µL，10×PCR buffer 2.5µL，dNTP 2µL，Taq酶0.5µL，ddH2O 17µL。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。扩增结束后，吸取2µL Loading buffer与产物混合均匀，吸取10µL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，150 V电泳20 min后，在凝胶电泳成像系统下，读取带形并拍照。

1.2.4 PCR扩增产物的克隆和序列测定

以烟草赤星病菌基因组DNA为模板，用烟草赤星病菌特异性引物AS1F/AS2F进行PCR扩增，得到340 bp的PCR产物。将PCR产物进行胶回收后连接到pEASY-T1载体上，并转化至Trans1-T1感受态细胞中，获得阳性菌落，提取含有目的DNA片段的质粒，由青岛派森诺基因科技有限公司进行测序。参考宋月等［17]的方法进行PCR产物纯化、质粒提取等。

1.2.5 标准曲线的制作

以10倍梯度稀释后的标准质粒作为扩增模板，采用SYBR qPCR Master Mix推荐的反应体系进行q-PCR扩增。以拷贝数的对数为横坐标，循环阈值（CT）为纵坐标制作标准曲线。根据标准曲线所得数据分析拷贝数与CT值之间的关系，并建立数学模型，检验相关性。

1.2.6 烟叶中赤星病菌q-PCR检测

赤星病接种：采用孢子悬浮液接种。参照沈奕等［18]的方法，即将赤星病菌在PDA平板上培养5～7 d后，用质量分数为1%的葡萄糖洗下，4层纱布过滤，将孢子悬浮液分别稀释至浓度为1×106、1×105、1×104、1×103和1×102个/mL。选取K326烟草品种进行试验，用针均匀刺伤烟草叶片，造成伤口，然后将稀释后的不同浓度病原菌孢子悬浮液用小型喷雾器均匀地喷洒在叶片上，以无菌水喷洒叶片为对照。

q-PCR检测：接种7 d后取样进行定量检测。参照汤文开等［19]的方法进行叶片总DNA的提取。将提取的叶片总DNA采用q-PCR体系进行检测。

1.2.7 数据分析

使用SPSS 22统计软件对数据进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。使用7500 Software v2.3软件进行标准曲线绘制。

2 结果与分析

2.1 普通PCR引物特异性和灵敏度的检测

本实验中的q-PCR体系采用SYBR Green I染料法，其前提是PCR反应的特异性，非特异性扩增和引物二聚体均会影响结果的准确性［20]。通过普通PCR技术检测5对引物的特异性，PCR结果显示（图1），仅AS1F和AS2R对烟草赤星病菌（A.alternata）有特异性，可以扩增出340 bp的特异性条带，而烟草黑胫病菌（P.parasiticavar.nicotianae）、棒孢霉菌（C.Güssow）及其他植物病原菌均未扩增出条带。扩增序列：CATTGGATGCCTAACCTTTGCTGATAGAGAGTG CGACTTGTGCTGCGCTCCGAAACCAGTAGGCC GGCTGCCAATTACTTTAAGGCGAGTCTCCAGCA AAGCTAGAGACAAGACGCCCAACACCAAGCA AAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGG CATGCCCTTTGGAATACCAAAGGGCGCAATGTG CGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGC AATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTG AAAGTTGTAATTATTAATTTGTTACTGAGCCTGA TTGCAA。说明该引物对烟草赤星病菌具有特异性，能够区分出其他的病原菌。

对不同浓度的DNA标准品进行PCR扩增，结果（图2）显示，最低能够检测到1 ng/µL的病原菌DNA。

2.2 q-PCR标准曲线的建立

各条扩增倾斜度较大、曲线光滑而且各个循环阈值间隔相等，q-PCR的检测灵敏度为1×10-3ng/µL，比常规PCR灵敏度提高了1×103倍（图3A）。标准品熔解曲线峰型单一，且熔点温度趋于一致，均为85.9℃左右，表明扩增产物单一，引物特异性好且无引物二聚体形成（图3B）。标准曲线y=-3.403 8x+39.265（R2=0.999 4），扩增效率约为97%（图3C），表明标准曲线可满足要求。

2.3 利用q-PCR体系检测叶片菌含量

根据q-PCR标准曲线，叶片中链格孢菌接菌量为1×106、1×105、1×104、1×103和1×102个/mL时，q-PCR扩增CT值分别为16.9、19.6、19.8、21.6和24.6，对照CT值为29.9。与对照相比，接种不同浓度孢子悬浮液的叶片中菌含量差异极显著，随着接菌量的增加，叶片中菌含量也显著增加（图4）。表明所建立的q-PCR体系较合理，可准确反映叶片菌含量。

3 结论

①设计了一对用于烟草赤星病菌检测的特异性引物，该引物特异性较好，可以有效检测烟草赤星病菌。②建立了实时荧光定量体系，可用于烟草叶片中赤星病菌的定量检测。③喷施不同浓度赤星病菌的烟草叶片中病原菌含量q-PCR检测结果表明，该体系可对烟叶中赤星病菌进行定量分析，可为烟草赤星病的有效监测提供借鉴。