不同方式发酵桑葚果酒的功能性及香气成分比较

汪沙，卢红梅，陈莉，牟灿灿，吴震，李荣源

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025）

桑葚（Mulberry fruit）为桑科落叶乔木桑树（Morus alba L.）的聚花果，又名桑果[1]。桑葚富含生物碱、多酚、黄酮类等化合物[2]，具有滋阴补血、保肝护肾、增强免疫力及促进新陈代谢等功效[3]；桑葚果不仅含有丰富的人体自身不能合成的多不饱和脂肪酸、氨基酸[4,5]，还有人体所需要的微量元素[6]，白藜芦醇具有保护心血管、神经系统、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗氧化和保肝等多种对人体有益的药理功能，还能激发某些人体内抑癌基因表达，抑制癌细胞生长，并能阻止形成血液栓塞，被誉为继紫衫醇之后又一种新的抗癌物质[7]。但桑葚不利于保藏，桑葚贮藏温度为6 ℃时，在第3 d就会发生腐烂[8]，因而以桑葚鲜果发酵而成的桑葚果酒集天然、营养、保健于一体，既能使不易贮藏的桑葚得到充分利用，又可丰富酒类品种、繁荣果酒市场。

不同的原料及发酵工艺得到的桑葚果酒品质和风味也不同，谭霄[9]用产γ-氨基丁酸酿酒酵母JM037酿造出的桑葚果酒检测出27种香气成分，刘伟[10]用葡萄酒果酒专用SY酵母酿造的桑葚果酒检测出58种香气成分，曾霞[11]通过对桑葚酒的工艺进行优化得到具有65种香气成分的桑葚果酒，目前，关于对影响桑葚果酒功能性及香气成分的工艺研究主要包括初始糖度、初始Ph、酵母菌株、发酵温度等的选择上，却鲜有研究发酵方式对其功能性及香气物质的影响。本文以分批发酵、分批补料发酵、分批带渣发酵三种发酵方式发酵桑葚果酒，对桑葚酒功能性物质含量进行对比，采用固相微萃取联合气相色谱-质谱（SPME/GCMS）对三种桑葚果酒香气成分进行分析测定，得出最佳的发酵方式。

1 材料与方法

1.1 主要材料

贵州省开阳县：九成熟的“大十”桑葚。

1.2 主要试剂

白藜芦醇：北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯：天津市科密欧化学试剂；有限公司；无水硫酸钠、氯化钠、氢氧化钠、可溶性淀粉、硼酸钠、酚酞：成都金山化学试剂有限公司；盐酸：天津市天大化工实验厂；碘：天津市津北精细化工有限公司；碘化钾：天津市致远化学试剂有限公司；胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：上海博微生物科技有限公司；次甲基蓝：天津光复化学试剂有限公司。以上皆为分析纯。

1.3 主要仪器

1260II高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；N-1100旋转蒸发仪、SB-1100水浴锅，上海爱朗仪器有限公司；Thermo赛默飞TRACE™1310气相色谱仪、JK-5L空气发生器、Thermo Fisher X2电感耦合等离子体质谱仪，北京京科瑞达科技有限公司；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F型洁净工作台，上海雷韵试验仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵工艺

1.2.1.1 分批发酵

对桑葚进行破碎取汁并依次加K2S2O5（160 mg/L）、果胶酶（30 mg/L），静置24 h后，过滤取清汁，添加白砂糖调整糖含量至240 g/L，添加酵母（300 mg/L）于发酵罐中进行发酵，发酵温度22～26 ℃，当糖含量降至4 g/L左右时，利用经杀菌的300目滤布进行过滤，在15 ℃环境下密封避光贮存1个月后，在10 ℃条件下进行满罐密封避光保存，陈酿时间3个月。

1.2.1.2 分批补料发酵

对桑葚进行破碎取汁，取果汁的四分之一按1.2.1.1进行发酵，剩下的果汁按1.2.1.1添加K2S2O5和果胶酶处理后，放入4 ℃冰箱中保存，分三次每隔一天平均补加剩下的桑葚果汁，其余处理同1.2.1.1。

1.2.1.3 分批带渣发酵

对桑葚进行破碎取汁，添加与果汁同等质量的桑葚渣后同1.2.1.1处理。

1.2.2 感官评价

选取10名经过专业培训有经验的感官评价人员对桑葚果酒进行感官评价，其感官评分细则如表1。

表 1感官评分细则Table 1 Details of sensory scoring

1.2.3 甲醇含量的测定

GC条件：进样口温度250 ℃，初始温度为50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至65 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至70 ℃，保持2 min后，以30 ℃/min升至250 ℃。检测器温度：250 ℃，氢气流量：40 mL/min，空气流量：350 mL/min，载气流量：40 mL/min，分流比：30:15，进样量：2 μL。

1.2.4 白藜芦醇的测定

参照《GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]。

1.2.5 总花色苷的测定

参照Giusti M M[13]

1.2.6 多酚的测定

参照李静[14]。

1.2.7 黄酮的测定

参照杨林娥[15]。

1.2.8 桑葚果酒挥发性成分的测定

GC条件：进样口温度为250 ℃，初始温度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保持6 min；载气为高纯He（99.999%）；载气流量为恒定流速1 mL/min。MS条件：离子源为EI源，离子源温度200 ℃，电子能量70 eV，发射电流1 mA，检测器电压2000 V，接口温度250 ℃。

1.2.9 数据分析

采用orign 8.6、excel对数据进行绘图、分析。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

如表2所示，分批发酵桑葚果酒感官评分（78）最低，分批补料发酵桑葚果酒感官评分最高（90），略高于分批带渣发酵桑葚果酒的感官评分（88），这表明分批补料发酵和分批带渣发酵能提高桑葚果酒的感官品质。

表2 感官评价结果/分Table 2 The results of sensory evaluation

2.2 不同发酵方式对桑葚果酒甲醇、白藜芦醇的影响

甲醇是果酒酿造过程中生成的副产物，人一旦摄入5 g会出现严重中毒，超过12.50 g可能导致死亡[16]。根据NY/T 1508-2017《绿色食品果酒》[17]中规定果酒的甲醇≤0.40 g/L，由图1可知，三种桑葚果酒均符合标准，分批带渣发酵桑葚果酒中甲醇含量高是因为桑葚果渣中的果胶在果胶酶的作用下生成甲醇，这与YURI L[18]研究结果相同。

图1 三种桑葚果酒中甲醇、白藜芦醇含量Fig.1 The content of methanol and resveratrol in three mulberry wines

白藜芦醇是桑葚酒重要的功能性成分，也是影响桑葚酒市场竞争力的一个重要因素[19]。分批带渣发酵桑葚果酒白藜芦醇含量（0.19 mg/100 mL）是分批发酵桑葚果酒9.79倍，分批补料发酵桑葚果酒的3.80倍，分批带渣发酵能显著提高桑葚果酒中白藜芦醇含量。

2.3 不同发酵方式对桑葚果酒多酚、黄酮、总花色苷的影响

多酚、黄酮、总花色苷具有抗癌、降血糖、护肝脏等多种生理功能，是影响桑葚果酒品质的重要指标[20]。由图2可知，分批带渣发酵桑葚果酒的多酚（2020.89 mg/L）、黄酮（310.56 mg/L）、总花色苷（97.25 mg/L）含量最高，分别比分批发酵桑葚果酒提高了32.07%、41%、29.29%，这表明带渣发酵有利于提高桑葚果酒中功能性成分的增加，有助于提高桑葚果酒的品质。

图2 三种桑葚果酒多酚、黄酮、总花色苷含量Fig.2 Retention rates of anthocyanins, polyphenols and flavonoids in three mulberry fruit wines

2.4 桑葚果酒中香气成分成分分析

2.4.1 不同发酵方式发酵桑葚果酒的总香气成分GC-MS分析

图3 分批发酵桑椹酒挥发性成分总离子图谱Fig.3 Total ion spectrum of volatile components in batch fermentation of mulberry wine

图4 分批补料发酵桑葚酒挥发性成分总离子图谱Fig.4 Total ion spectrum of volatile components in fed-batch fermentation of mulberry wine

图5 分批带渣发酵桑葚酒挥发性成分总离子图谱Fig.5 Total ion spectrum of volatile components of mulberry wine in batch fermentation with residue

本试验在3种桑葚果酒样品中共检测出191种香气成分。如图6和表3所示，主要香气物质有20种（百分含量＞1%），酯类种类和酯类、醇类百分含量高于其他种类香气成分，烯类、酚类、苯类百分含量最低。分批发酵桑葚果酒含烷烃类9种（2.55%）、醇类13种（25.96%）、酯类55种（54.71%）、醛酮类25种（5.34%），酸类11种（5.44%），苯环及酚类9种(0.45%），烯类2种(0.13%），其他物质9种(1.60%），共计133种；分批补料发酵桑葚果酒含烷烃类10种（1.60%）、醇类14种（26.36%）、酯类61种（57.48%）、醛酮类22种（4.43%），酸类12种（5.59%），苯环及酚类10种（0.60%），烯类2种（0.20%），其他物质11种（1.43%），共计142种。分批带渣发酵桑葚果酒香气成分种类最多，含烷烃类9种（1.43%）、醇类16种（29.70%）、酯类57种（6.20%）、醛酮类27种（4.64%），酸类11种（3.62%），苯环及酚类10种（0.68%），烯类4种（0.70%），其他物质12种（1.35%），共计146种。三种不同发酵方式发酵的桑葚果酒风味物质种类均高于孔燕[21]（44种）、曾霞[11]（70种）、商敬敏[22]（28种）等人发酵的桑葚果酒。

图6 挥发性物质种类（a）、百分含量图(b)Fig.6 Types of volatile substances (a) and percentage content diagram (b)

表3 三种桑葚酒主要香气成分含量表（百分含量＞1%）Table 3 Contents of main aroma components of three mulberry wines

由图7可知，三种桑葚果酒中共有香气物质99种。分批发酵和分批补料发酵、分批带渣发酵共有香气物质17、11种，分批补料发酵和分批带渣发酵共有香气物质4种；分批发酵、分批补料发酵、分批带渣发酵分别含特有香气物质19、22、19种。

图7 三种桑葚果酒香气成分venn图Fig.7 Venn diagram of aroma components in three mulberry wines

2.4.2 醇类组分比较

醇类主要是酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物[23]。分批发酵、分批补料发酵、分批带渣发酵桑葚果酒醇类占各自香气成分总量的25.96%、26.37%、29.70%。醇类多具有不愉快的香气，但在三种桑葚果酒共有的主要醇类中，3-甲基-1-丁醇（分批发酵10.32%、分批补料发酵16.70%、分批带渣发酵15.33%）百分含量最高，赋予桑葚酒特殊的植物香，乙醇（3.59%、3.61%、3.48%）具有特殊的、令人愉快的香味，苯乙醇（10.26%、3.40%、6.02%）具有独特的玫瑰花香、丁香、茉莉花香等多样风味。

2.4.3 酯类组分比较

酯类是发酵酒挥发性成分的重要组成部分，也是构成香气骨架的关键成分[24]，三种桑葚果酒中共检测出酯类物质77种，其中主要酯类物质有10种，辛酸乙酯百分含量（10.80%、10.00%、10.66%）最高，具有菠萝香、苹果香、似白兰地酒香，其次为癸酸乙酯（5.34%、10.11%、10.50%）、乙酸乙酯（7.83%、9.87%、8.78%），具有梨香、椰子香、葡萄酒香、白兰地香和果香，剩下的乙酸异戊酯（1.73%、1.94%、3.24%）、庚酸乙酯（0.55%、0.94%、1.49%）、月桂酸乙酯（6.00%、6.54%、5.36%）、肉豆蔻酸乙酯（0.44%、1.46%、0.61%）、乙酸苯乙酯（2.83%、3.83%、1.31%）、己酸乙酯（5.93%、6.38%、0.07%）分别赋予了桑葚果酒苹果香、菠萝香、花香、椰子香等香味，草酸二丁酯（4.90%）是分批发酵桑葚酒中特有的酯类物质，呈菠萝香、似朗姆酒香。

2.4.4 其他组分比较

三种桑葚酒中检测出的除醇类、酯类的其他组分共97种，共有主要香气成分有苯甲醛（0.08%、0.64%、1.09%）：杏仁香；辛酸（1.04%、0.96%、0.57%）：呈水果香气；乙醛（1.56%）为分批发酵桑葚酒主要香味物中特有的香气成分，具有果香、咖啡香、酒香、青香。乙酸为分批发酵（3.38%）、分批补料发酵（3.79%）桑葚酒共有香气成分，呈酸味。

2.5 分批带渣发酵桑椹酒中的特有香气物质分析

分批带渣发酵桑葚果酒特有的香气物质共有17种：3-甲基丁醛、正丁醇、异丙醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇、壬醇、丁酸乙酯、庚酸甲酯、2-辛烯酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯丙酸乙酯、β-月桂烯、3-蒈烯、3-甲基丁酸、反式-2-己烯酸、2-庚酮、2,5-二甲酰基呋喃。其中3-甲基丁醛具有苹果香；1-辛烯-3-醇有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气；壬醇带有甜而青的玫瑰花蜡和果香的脂蜡香气；丁酸乙酯极易扩散，带有清灵强烈的甜果香，有菠萝、香蕉、苹果气息；苯甲酸甲酯具有浓郁的冬青油香气；3-蒈烯具有强烈的松木样香气；2-庚酮有类似梨的水果香味。

2.6 主要香气成分与感官得分相关性分析

图8 香气成分与感官得分的相关性热图Fig.8 Heat map of the correlation between aroma components and sensory scores

20种主要香气成分含量与桑葚酒各模块感官评价得分的相关性如图所示，香气成分含量与滋味和澄清度相关性不大；乙醛、苯乙醛、草酸二丁酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸、己酸乙酯与香气呈正相关，肉豆蔻酸乙酯、辛酸、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯与香气呈负相关；乙醛、乙醇、苯乙醇、草酸二丁酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、苯甲醛、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙基9-癸烯酸酯与桑葚果酒的典型性相关性最为显著，前8种呈负相关，后7种呈正相关。

3 结论

分批补料发酵、分批带渣发酵桑葚果酒感官评分明显高于分批发酵；分批带渣发酵桑葚果酒功能性成分含量最高，白藜芦醇含量（0.19 mg/100 mL）是分批发酵桑葚果酒9.79倍，分批补料发酵桑葚果酒的3.80倍，总花色苷97.25 mg/L，是钮成拓等[25]发酵的桑椹酒的1.29倍；黄酮（310.56 mg/L）、多酚（2020.89 mg/L）；分批带渣发酵香气成分最多（146种）；分批发酵特有的主要香气成分最多（2种），总香气成分种类最少（133种）；分批补料发酵桑葚酒含香气成分142种。三种不同发酵方式发酵的桑葚果酒风味物质种类均高于孔燕[21]、曾霞[11]、商敬敏[22]等人发酵的桑葚果酒。20种主要香气成分与桑葚果酒典型性的相关性最为显著。以感官评价、功能性成分、香气成分对三种发酵方式得到的桑葚果酒进行综合评价，分批带渣发酵不仅有利于桑葚果酒功能性成分含量的提高，还能增加桑葚酒风味物质的多样性。