Plackett-Burman联合效应面法优化超声辅助乙醇提取枳雀总酚工艺

张震，石凯欣，潘思轶

华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070

最新的大规模流行病学研究表明，药用植物因其副作用小、治疗靶点多，已成为治疗心血管疾病、功能性和慢性胃肠道疾病、癌症等复杂机制疾病的重要选择[1]。枳雀(CitruswilsoniiTanaka)，又名香圆、宜昌柠檬等，属芸香科柑橘属，其果皮较厚，种子大而多，味极酸苦而具有香气[2]。枳雀始载于《神农本草经》，具有理气宽中、行滞消胀的功效，为历版《中国药典》所收载，也是国家卫生健康委员会颁布的可用于保健食品的原料。众所周知，酚类物质是柑橘果实中最丰富的代谢产物，柑橘酚类物质在抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、调节免疫功能、改善胃肠道功能等方面功效显著，且安全性高、无副作用[3]。

超声辅助提取技术在溶剂消耗和能量输入方面是一种环境友好的非热技术，超声波用于活性物质的提取受到广泛关注[4-5]。吴梅青等[6]研究发现柑橘皮超声提取液中的多酚抗氧化能力显著高于微波提取法、回流提取法、水提法和碱溶酸沉法。同时，Khan等[7]报道了超声优化后的柑橘皮总酚含量为275.8 mg/100 g，柚皮苷和橙皮苷的含量分别为70.3和205.2 mg/100 g，显著高于传统的提取方法。由此可见，超声波辅助提取生物活性成分具有节能、省时、高效的优势。

本研究采用Plackett-Burman联合星点设计-效应面法(central composite design response surface design,CCD-RSM)评估和优化了影响超声辅助乙醇提取枳雀总酚含量的工艺参数，旨在最大限度提高枳雀酚类物质的得率，并采用HPLC法对枳雀提取液的酚类物质进行定性定量分析，以期为枳雀活性物质的深加工及应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜枳雀(CitruswilsoniiTanaka)果实，购自陕西省城固县果业局。将果实冷冻干燥至恒质量后过孔径0.15 mm的标准筛，将得到的枳雀冻干粉在-20 ℃避光保存，备用。18种酚类物质的色谱级标准品(≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；色谱级甲醇和甲酸均购自美国Fisher公司；Folin & Ciocalteu酚试剂购自美国Sigma公司；其他分析级的化学药品和试剂均购自上海国药控股化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

QE-100g高速万能粉碎机，浙江屹立工贸有限公司；KQ-300DE超声波清洗器，江苏昆山市超声仪器有限公司； Waters e2695仪，美国Waters公司；UV-1800紫外分光光度计，日本岛津科学仪器公司。

1.3 超声波辅助乙醇法提取枳雀酚类物质

精确称取1 g枳雀冻干粉置于锥形瓶中，用锡箔纸包裹避光并用橡胶塞密封，采用超声波辅助乙醇提取，将获得的混合物在4 ℃以8 000 r/min离心15 min，收集上清液，并在40 ℃浓缩以除去乙醇。最后，将枳雀提取物以80%甲醇和二甲亚砜(体积比1∶1)定容于25 mL棕色容量瓶中，待检测。

1.4 枳雀总酚含量的测定

根据Cliffe等[8]的方法并适当修改测定枳雀提取物中的总酚含量。取1 mL稀释待测液和5 mL 10%的 Folin & Ciocalteu酚试剂，混匀后避光静置5 min，加入4 mL 75 g/L Na2CO3溶液，在40 ℃的水浴中反应10 min，最后在760 nm处进行吸光度的测定。以不同质量浓度梯度的没食子酸对照品溶液制备标准曲线，得到没食子酸标准曲线方程为y=9.9780x+0.0196，R2=0.999 3。样品中的总酚含量以每克枳雀冻干粉样品中所含没食子酸当量表示，单位为mg/g，计算公式如下：

总酚含量=CVn/m

(1)

式(1)中，C为单位体积枳雀提取物的没食子酸质量，mg/mL；V为所得枳雀提取物的总体积，mL；n为紫外分光法测定时样品的稀释倍数；m为枳雀冻干粉的总质量，g。

1.5 单因素试验设计

采用本文“1.3”的处理方法，分别考察浸泡时间、液料比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度共5个因素对枳雀总酚含量的影响。固定液料比40 mL/g、乙醇体积分数80%、超声时间20 min、超声温度30 ℃的提取条件，考察浸泡时间为0、5、10、15、20、25、30 min 对总酚含量的影响；固定浸泡时间15 min、乙醇体积分数80%、超声时间20 min、超声温度30 ℃的提取条件，考察液料比为10、20、30、40、50、60 mL/g 对总酚含量的影响；固定浸泡时间15 min、液料比40 mL/g、超声时间20 min、超声温度30 ℃的提取条件，考察乙醇体积分数20%、40%、60%、80%、100% 对总酚含量的影响；固定浸泡时间15 min、液料比40 mL/g、乙醇体积分数80%、超声温度30 ℃的提取条件，考察超声时间为5、10、15、20、25、30 min 对总酚含量的影响；固定浸泡时间15 min、液料比40 mL/g、乙醇体积分数80%、超声时间20 min的提取条件，考察超声温度为15、20、25、30、35、40 ℃对总酚含量的影响。根据单因素试验结果初步确定各因素的较优范围。

1.6 Plackett-Burman试验设计

采用Plackett-Burman试验对5个自变量进行关键因素的筛选，每个变量都以高和低2个级别表示，以枳雀提取物总酚含量为指标，选择对枳雀总酚含量贡献最大的3个因素做进一步分析。

1.7 星点设计-效应面试验设计

根据Plackett-Burman试验设计的结果，选择乙醇体积分数、液料比、超声温度共3个因素，以枳雀提取物的总酚含量为响应值，使用包含3个因子和5个编码级的CCD来拟合二阶响应面，并设计6个重复的中心点用于估计纯误差。按照Design-Expert 10.0.7软件设计CCD矩阵影响因子相应的编码水平进行试验。

1.8 枳雀提取物各酚类物质单体成分与含量的检测

HPLC法参考张元梅等[9]的方法，并稍作修改。色谱分离在ZOR-BAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)中进行，流动相由0.1%的甲酸水溶液(溶剂A)和甲醇(溶剂B)组成，梯度洗脱程序如下：0～20 min，37%～50% B；20～35 min，50%～80% B；35～40 min，80%～100% B。综合考虑可分4个波长进行检测，即芦丁的检测波长为 260 nm，儿茶素、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、圣草酚、肉桂酸和柚皮素的检测波长为 283 nm，绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、甜橙黄酮、川陈皮素和桔皮素的检测波长为 330 nm，杨梅素、槲皮素、山奈酚的检测波长为 367 nm，紫外吸收光谱辅助定性。枳雀提取物和各标准溶液经0.22 μm的微孔有机滤膜过滤后进行HPLC检测分析。

1.9 数据处理

每组试验重复3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。运用SPSS Statistics 23软件对数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 枳雀酚类物质提取工艺的单因素试验

从图1A可见，在0～30 min，枳雀多酚含量随着浸泡时间的延长，呈现先升高后降低的变化趋势。在浸泡15 min时进行超声提取所得的总酚含量最高，为14.66±0.15 mg/g。随着浸泡时间的延长，枳雀总酚含量迅速下降，浸泡25 min后的枳雀总酚含量仅为最高含量的70%左右。这可能是由于浸泡时间过短，枳雀冻干粉不能很好地分散，有些甚至聚集在溶剂中，因反应接触面积的减少而影响了其总酚得率。另一方面，浸泡时间过长会使枳雀组织中的糖类、蛋白质等扩散出来，甚至形成胶团依附于粉末表面，阻碍了枳雀多酚的溶出，导致其含量降低。综上，选取浸泡时间10～20 min用于筛选试验。

从图1B可见，随着液料比由10 mL/g增加到30 mL/g，总酚含量明显增加，在液料比40 mL/g时，总酚含量达到最大值14.15±0.35 mg/g，随着溶剂比例的增加，枳雀总酚含量开始减少并逐步稳定。溶剂量的增加使得细胞内外多酚浓度差变大，并且平衡会向胞外溶液倾斜而使得溶液浓度增大。基于低成本和高效率的考虑，选取液料比30～50 mL/g进行筛选试验。

从图1C可见，随着乙醇体积分数的增加，枳雀总酚含量呈现先增加后减少的趋势。在乙醇体积分数为40%时，枳雀总酚含量达到最高，为15.66±0.51 mg/g。在100%乙醇提取时，枳雀总酚含量骤降至9.06±0.51 mg/g，显著低于其他组。过高的乙醇体积分数会使枳雀中的醇溶性和脂溶性杂质竞争性溶出，导致提取的枳雀酚类物质的总含量降低。综上，选择乙醇体积分数30%～50%进行筛选试验。

同一组数据中不同字母表示差异显著(P<0.05)。Values followed by different letters in the same group showed statistically significant(P<0.05).

从图1D可见，枳雀总酚含量随着超声时间的延长呈现先增加后趋于稳定的变化趋势，在超声时间为20 min时获得最高含量为14.38±0.35 mg/g。从节约时间及能源的角度，选取超声时间15～25 min进行筛选试验。

在超声提取过程中，对温度的控制至关重要。从图1E可见，枳雀总酚含量随着超声温度的上升呈现逐渐增加的趋势，并在35 ℃达到最大值(15.54±0.32 mg/g)，比15 ℃时的总酚含量增加了52.80%。因此，选取超声温度30～40 ℃进行筛选试验。

2.2 Plackett-Burman试验设计筛选影响枳雀总酚含量的主要因素

使用Plackett-Burman法进行初步的因素筛选试验。以枳雀总酚含量为响应值，通过软件Design-Expert 10设计了12次试验。结果发现，枳雀冻干粉和30%乙醇按液料比50 mL/g浸泡20 min后，在30 ℃超声处理25 min时，可观察到最低的枳雀总酚含量，为11.42±0.08 mg/g；枳雀冻干粉和50%乙醇按液料比30 mL/g浸泡10 min后，以40 ℃超声处理25 min，此时，可获得最高的枳雀总酚含量，为16.08±0.44 mg/g。

贡献百分比可用于衡量各因素对响应值的影响程度的大小。由表1可知，5个因素对枳雀总酚含量的影响程度由高到低为：B>C>E>D>A，乙醇体积分数(68.52%)>液料比(13.39%)>超声温度(8.59%)>超声时间(4.15%)>浸泡时间(0.95%)，其中，浸泡时间和液料比对枳雀总酚得率的提高有显著的负效应，而乙醇体积分数、超声时间和超声温度具有显著的正效应。

表1 Plackett-Burman设计中各种因素对总酚含量的影响 Table 1 Influence of various factors on total phenol content in Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman试验的方差分析 Table 2 Analysis of variance table for the Plackett-Burman design experiment

综上所述，固定最佳的浸泡时间为15 min和超声时间为20 min(图1)，选择乙醇体积分数、液料比和超声温度进行进一步的考察，分析这3个因素及其相互作用对枳雀总酚含量的影响。

2.3 星点设计-效应面法确定枳雀酚类物质的最佳提取条件

根据Plackett-Burman试验中获得的结果，使用CCD法进一步优化了提取参数，发现枳雀总酚含量为11.89±0.36～16.35±0.26 mg/g，波动范围较大。

如表3所示，通过方差分析对CCD-RSM模型进行了评估。模型的P值小于0.001意味着不同处理间差异极显著，模型可信度高。同时，不显著的失拟项(P>0.05)和较低的纯误差(0.13)意味着该模型是精确且适用的。3个一次项、3个二次项及交互项AC对枳雀总酚含量的影响显著(P<0.05)，根据F值大小得出各项对响应值的影响程度由强到弱依次为：C2>A2>A>B2>B>AC>C>BC>AB。由响应面分析得出的多元回归方程为：Y=-20.3584+0.4802A+0.5174B+0.7403C+0.0016AB+0.0049AC-0.0034BC-0.0084A2-0.0050B2-0.0105C2，其中，Y、A、B、C分别表示枳雀总酚含量、乙醇体积分数、液料比、超声温度。

表3 CCD-RSM模型的单因素方差分析表 Table 3 Analysis of variance for the central composite design response surface model

由图2的等高线图可知，乙醇体积分数和超声温度之间存在显著的交互作用，其等高线图呈现椭圆形或鞍形，该结果与方差分析结果(表3)一致(P<0.05)。同时，乙醇体积分数和液料比之间的交互作用以及液料比和超声温度之间的交互作用并不显著(P>0.05)，其等高线图形状接近圆形。

由图2的三维响应曲面图可知，在选定的因素范围内，枳雀总酚含量随着单因素值的上升呈现先增加后减少趋势。其中，反映乙醇体积分数和超声温度的交互作用的响应曲面坡度最陡，表明其交互作用能够显著影响枳雀总酚的含量。

图2 乙醇体积分数、液料比和超声温度的交互作用对枳雀总酚含量的影响

通过 Plackett-Burman联合CCD进行的优化试验获得的最佳条件是：浸泡时间15 min、乙醇体积分数44.254%、液料比45.529 mL/g、超声温度34.208 ℃、超声时间20 min，此时的枳雀总酚含量为16.260 mg/g。根据实际情况，调整参数为：浸泡时间15 min、乙醇体积分数44%、液料比45.5 mL/g、超声时间20 min、超声温度34 ℃、共进行了5次验证试验。结果发现，该条件下枳雀总酚含量的实际值为16.29±0.12 mg/g，接近于预测值。因此，通过Plackett-Burman设计与星点设计响应面方法相结合优化枳雀酚类物质的提取是可靠且实用的。

2.4 枳雀提取物酚类物质组成成分分析

由图3和表4可知，从枳雀提取物中同时分离出18种酚类化合物，其中，二氢黄酮类物质在枳雀提取物中含量最为丰富，约占总酚含量的94.60%，主要包括圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、圣草酚和柚皮素6种。枳雀富含柚皮苷，含量约为12.00 mg/g，约占总酚含量的91.36%，是其苦味的主要来源之一，其次含量较多的是圣草酚(176.91 μg/g)。此外，从枳雀提取物中检测到少量酚酸类物质，包括绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸。还检测出少量多甲氧基黄酮类物质，如：甜橙黄酮、川陈皮素和桔皮素，含量分别为30.46、21.74和10.86 μg/g。

表4 枳雀提取物中酚类化合物的含量 Table 4 The concentrations of phenolic compounds in Citrus wilsonii Tanaka extract

数字代表的物质同表4。The substances represented by the numbers are the same as those in Table 4.

3 讨 论

3.1 枳雀多酚的超声提取工艺

据报道，超声可以通过影响溶剂的物理性质、酚类物质的溶解度及某些酶的活性来增加超声的处理效果[10-11]。Ma等[11]发现超声辅助果胶酶提取柑橘渣水提物中的橙皮苷和酚酸时，底物结合和产物释放过程加速，且果胶酶与果胶底物之间的亲和力增强，这可能是由于在超声场下暴露了果胶酶结构中更多的活性位点所致，从而使提取率增加。Plackett-Burman试验的结果表明乙醇体积分数是影响枳雀总酚提取率最主要的因素。柳萌等[12]认为乙醇与水的混合液可以破坏酚类物质与蛋白质、多糖等物质的结合键，有利于酚酸的提取。由响应面图结果可知，溶剂极性和温度显著影响酚类物质的降解效果。多酚得率随着超声温度的上升而增加，可能得益于超声波在液体介质中的传播会产生强烈的混合效果，有助于提高质量传递，从而大大提高了溶质的传递速率[13]。然而，当温度过高时，一方面会导致溶剂的黏度和表面张力均降低，蒸气压升高，使得空化作用的气泡破裂程度降低，超声处理的效果减弱；另一方面，酚类物质属于易热降解的活性成分，高温会破坏多酚的结构，导致其产率降低[14]。在本研究中，响应面图中多酚含量随温度的升高呈现先增加后降低的趋势，这与上述研究报道的结果相一致[12-14]。

此外，在超声提取过程中，单个酚酸含量的下降程度与其芳香环取代基的类别和数目有关，羟基数目越多、甲氧基数目越少，酚酸越容易被降解，因此，枳雀多酚提取物中的多甲氧基黄酮被较好地保留[15]。除此之外，糖基的存在可有效抑制酚类物质的降解。Biesaga等[16]发现经超声提取后，蜂蜜中的9种酚酸和4种黄酮糖苷都很稳定，而7种苷元的回收率仅10%，黄酮醇苷元几乎完全降解。因此，实际生产中应根据目标产物的结构特性来选择适当的提取参数。

3.2 枳雀的组成成分分析

柑橘类水果中含有丰富的酚类物质，本研究通过HPLC对枳雀超声提取物进行分析，共检测出18种酚类物质，其中，柚皮苷的含量最高，其次是圣草酚。枳雀常作为枳壳、香橼等中药材的原料，用于破气消积，化痰散痞，疏肝理气等。陕南枳雀提取物中含有大量的柚皮苷，但却仅含有微量的新橙皮苷，其质量不满足我国药典规定的香橼原材料的要求，但是满足作为枳壳原材料的规定，该结果与杨辉等[17]的研究结果一致。因此，枳雀作为枳壳与香橼原料入药的安全性和药理作用等方面还有待进一步研究。

枳雀提取物中含有约90%以上的二氢黄酮类物质。二氢黄酮类化合物是药用植物中广泛存在的一类黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、清除自由基、保护神经、治疗心血管疾病及调理肠胃功能、抗炎、抗菌等多种药理活性。因此，二氢黄酮类物质可能是枳雀在各类疾病治疗中发挥作用的关键活性物质。作为一种母本为柚类、父本为枳类的杂交柑橘品种，枳雀中检测出丰富的多甲氧基黄酮。研究发现，甜橙黄酮和川陈皮素等多甲氧基黄酮部分通过影响磷酸二酯酶的活性起到抑制TNF-α的作用，具有很好的抗炎作用[3]。此外，任雪等[18]提出广陈皮的多甲氧基黄酮提取物可通过减弱或消除氧自由基及炎症介质的过度释放，对小鼠肺组织起到保护作用。因此，我们推测枳雀具有潜在的抗炎活性，可用于慢性炎症疾病的治疗方案中。

目前，国内外对枳雀活性成分的提取分离以及体外活性研究较多，而枳雀调节胃肠道健康、治疗心血管疾病、调节免疫功能的机制并不明确，未来需要进一步探索枳雀对人体健康的干预机制，以期为临床应用提供理论依据。