食品中沙门氏菌检验能力验证分析

◎ 胡淑青

（从化海关综合技术服务中心，广东 广州 510900）

实验室质量控制方式主要分为外部质量控制和内部质量控制两大类。参加能力验证活动是认可实验室开展外部质量控制的重要方式之一，可直观显示参试实验室的技术能力，帮助参试实验室及时发现潜在问题并及时采取纠正或预防措施，进而提高实验室运行管理的能力与信心。

沙门氏菌属（Salmonella）分类属肠杆菌科，是一类分布广泛、血清型较多、抗原复杂的肠道病原菌[1]，可引起人类的伤寒、副伤寒、感染性腹泻、食物中毒和医院内感染，并引起动物发生沙门氏菌病[2]。引起沙门氏菌中毒的食品主要是肉类、蛋类和乳类，日本则以鱼类为多，我国以肉类食品为主，主要是牛肉、猪肉和马肉[3]。

从化海关综合实验室常年承担的食品法定检验及社会委托检验中，沙门氏菌是微生物检验的常检项目。实验室于2020年8月参加广州海关技术中心组织的“IQTC20B12食品中沙门氏菌的检验”能力验证项目。根据国标《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）[4]对两样品进行检验，最终获得满意的结果评价。

1 材料与方法

1.1 样品来源

两待测样品编号分别为PT082和PT126，为西林瓶密封装的菌株冻干粉，由广州海关技术中心提供。

1.2 培养基及试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）颗粒培养基、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、沙门氏菌属显色培养基、三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基、营养琼脂（NA）平板和EasyID沙门氏菌生化鉴定盒，均购自广东环凯微生物科技有限公司。沙门氏菌诊断血清（A-F），购自宁波天润生物药业有限公司。

1.3 参考标准菌株

鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028），购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。

1.4 仪器设备

MDF-192N超低温冰箱（日本SANYO）；HVA-85高压蒸汽灭菌锅（日本HIRAYAMA）；GI7-2生化培养箱（美国SHEL LAB）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO）；Mili-Q Direct 16超纯水机（美国MILLIPORE）。

1.5 方法

1.5.1 样品处理及预增菌

从超低温冰箱（-80 ℃）取出待测样品，静置至室温。西林瓶内含奶粉为基质的冻干粉，在生物安全柜内无菌操作开启西林瓶，加入5 mL灭菌生理盐水复溶，用无菌吸管转移样品液体至盛有225 mL灭菌BPW的锥形瓶中，随后每次5 mL分4次用灭菌生理盐水润洗西林瓶后将清洗液回收至上述锥形瓶中。编号PT082和编号PT126样品分别处理后做好编号标记。同样方式接种鼠伤寒沙门氏菌做阳性对照。

将预处理后的编号分别为PT082和PT126的锥形瓶置于生化培养箱（36 ℃）培养18 h。

1.5.2 增菌

轻摇PT082、PT126和对照组的BPW培养物，各移取1 mL，分别转于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液，轻轻摇匀。SC置于生化培养箱（36 ℃）培养22 h，TTB置于生化培养箱（42 ℃）培养22 h。

1.5.3 选择性分离

轻摇增菌液，将其分别划线接种于BS平板、XLD平板、HE平板和沙门氏菌属显色平板。接种后的XLD平板、HE平板和沙门氏菌属显色平板置于生化培养箱（36 ℃）培养24 h，BS平板培养48 h。

1.5.4 生化试验

对照国标，自选择性平板上挑取典型或可疑菌落，接种三糖铁（TSI）琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺，无需换新接种环，继续接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂（NA）平板，置于生化培养箱（36 ℃）培养24 h。

对照国标，对初步生化试验结果判断为可疑沙门氏菌属的菌落使用EasyID沙门氏菌生化鉴定盒进行鉴定。

1.5.5 血清学鉴定

将步骤1.5.4符合沙门氏菌属生化反应特性的菌落进行血清凝集试验。在无菌培养皿上滴加1滴沙门氏菌诊断血清（A-F），用无菌接种环挑取单菌落于诊断血清中轻轻搅拌匀，观察是否有颗粒状的凝集现象。同时用生理盐水作对照排除菌落自凝可能性。

2 结果与分析

2.1 选择性分离结果

各选择性平板的菌落特征见表1。对照国家标准，观察到编号PT082样品在SC增菌液以及编号PT126样品在TTB增菌液分别划线接种的培养物在选择性平板的菌落形态特征疑似沙门氏菌。同时，观察到编号PT082样品在TTB增菌液以及编号PT126样品在SC增菌液分别划线接种的培养物在选择性平板的菌落形态特征与沙门氏菌的菌落特征相似度不大。

表1 选择性琼脂平板上菌落形态表

2.2 初步生化试验结果

样品初步生化试验结果见表2。其中，XLD（PT082，SC）表示编号PT082样品在SC增菌液划线接种的XLD平板；BS（PT126，TTB）表示PT126样品在TTB增菌液划线接种的BS平板；HE（PT126，SC）表示编号PT126样品在SC增菌液划线接种的HE平板；沙门氏菌属显色平板（对照，TTB）表示阳性对照品在TTB增菌液划线接种的沙门氏菌属显色平板。对照国家标准，初步判断样品PT082和样品PT126为可疑沙门氏菌属。

表2 样品初步生化试验结果表

2.3 全面生化鉴定结果

样品全面生化试验结果见表3。

表3 样品全面生化试验结果表

2.4 血清学鉴定结果

样品血清学鉴定结果见表4。对照国标，综合表1～表4，可判定本次能力验证两样品（PT082和PT126）均检出沙门氏菌。

表4 样品血清学鉴定结果表

3 结论与讨论

采用传统国标方法检验沙门氏菌，耗时较长但方法成熟，仍是目前较为通用的检验方法。利用BPW预增菌，可以使沙门氏菌得到一定的增殖，提高阳性检出率。在实际检验中，对于未加工的生鲜食品或污染较严重的样品，可使用SC增菌液和TTB增菌液直接增菌。在选择性琼脂平板的选择上，国标法显示BS平板是必需，再另选XLD平板、HE平板、显色平板其中之一搭配使用。BS平板较之于上述3种平板培养时间较长，一般需要培养48 h，在实际检验中，建议选用3种或以上选择性平板分离培养细菌。特异性和灵敏度较强的显色培养基推荐使用，可辅助提高检验效率。

国标法显示，初步生化试验中利用三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基反应结果首先排除非沙门氏菌的可能性。三糖铁琼脂因含有乳糖、蔗糖和葡萄糖3种糖（比例为10∶10∶1）而得名。只能利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸使斜面先变黄，但因葡萄糖量少，生产的少量酸因接触空气而氧化。斜面葡萄糖被分解完，蛋白胨继而被细菌利用从而产碱，故斜面由黄变为深红（通过酚红指示剂显示）。琼脂底部处于缺氧状态，酸类物质难以挥发，因此保持黄色。三糖铁变黑原因在于某些细菌能够将硫代硫酸钠还原为硫化氢，硫化氢与硫酸亚铁铵中的铁盐生成黑色硫化亚铁。样品HE（PT126，SC）的三糖铁琼脂反应结果为A/A，产气（+），产硫化氢（-），配合赖氨酸试验阴性结果，可判断此细菌为非沙门氏菌。最后补充说明，三糖铁琼脂斜面可以自制亦可选用生物公司生产的即用型，自制斜面选用试管塞加塞试管方式，带微孔的试管塞可让细菌培养时候较为均匀利用空气成分呼吸代谢；而即用型斜面多采用旋钮盖子加盖玻璃瓶子方式（由于生产灭菌流程及运输储存需要），因此在培养过程中，建议旋上盖子七八成松紧度，既可以令细菌利用糖类代谢产生的酸性物质及气体缓慢挥发，亦可避免盖子旋紧度不够情况下，某些细菌利用糖类大量产酸产气导致空间内气压过高将盖子冲出。

本次能力验证实验最后一步血清学鉴定，用沙门氏菌O多价血清（A～F）进行凝集分群（95%以上的沙门氏菌属属于A～F群），只鉴定到属。回看国标，沙门氏菌血清型分型是选做项目，需要进一步利用O因子血清将可疑菌鉴定到群，再用H因子血清第一相（特异相）定型，最后用H因子第二相（非特异相）辅助定型。沙门氏菌属在电镜下观察形态相似，可是基于其表面的O抗原和H抗原的不同组合却能分出许多血清型。据美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）资料显示，超过2 500种沙门氏菌血清型已被区分并命名，但由于众多血清型都非常罕有，科学家们对其了解尚不深入[5]。

本次能力验证报告两样品均检出沙门氏菌，获得组织方的满意评价。参加能力验证活动，可以夯实实验室技术能力，对于参试实验人员而言，亦是一次很好的实践机会。