针药结合对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦RhoA/ROCK/MLC信号通路的影响❋

崔晶晶， 付 晓

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病患者常见的慢性胃肠道并发症，是指在排除机械性梗阻情况下出现的胃排空延迟及胃肠动力障碍，不仅妨碍降糖药物的吸收，还会增加糖尿病并发症风险，部分患者会产生抑郁等心理问题，影响患者对糖尿病的自我管理[1]。目前，DGP的发病机制尚未明确。相关研究显示，胃平滑肌细胞病变是DGP产生的关键环节[2]，Ras同源物基因组成员A/Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶(ras homologous genome members A/Rho protein-related curl spiral kinase-2，RhoA/ROCK)信号通路及其下游效应分子可调节平滑肌收缩，在糖尿病并发症的发生发展中起重要作用[3]。西医治疗DGP主要以促胃肠动力药为主，疗效不理想，不良反应大且易复发，中医疗法不仅能改善DGP症状，而且能在一定程度上改善血糖水平[4]。本实验拟通过观察针药结合对DGP大鼠胃肠动力及RhoA/ROCK/MLC信号通路的影响，探讨该治法的疗效及可能的作用机制，以期为临床治疗DGP提供新方法及理论依据。本研究已通过锦州医科大学实验动物伦理委员会审查。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

益气健脾中药复方组成：太子参、鸡内金、木香各15 g，茯苓25 g，白术、炙甘草、砂仁各10 g，焦麦芽、焦山楂、焦神曲各30 g。将免煎配方颗粒(北京康仁堂药业有限公司)用去离子水配制成0.5 g/mL备用。多潘立酮片(吗丁啉)产自西安杨森制药有限公司(国药准字 H10910003)，用去离子水配置成0.315 mg/mL备用。

1.2 动物

SPF级健康雄性SD大鼠66只，6～7周龄，体质量200～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号SCXK(京) 2014-0004。饲养于锦州医科大学生理实验室动物房，温度24 ℃，湿度40%～50%。

1.3 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(Sigma公司)货号S0130；磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain ，p-MLC)抗体(货号#3671)、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚单位1(phosphorylated myosin phosphatase target subunit 1，p-MYPT1)抗体(货号#5163)，Cell Signaling Technology公司；Ras同源物基因组成员A(ras homologous genome members A，RhoA)抗体(货号WL02853)、Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶2(Rho protein-related curl spiral kinase-2，ROCK2)抗体(货号WL00550)、β-actin抗体(货号WL01845，万类生物科技有限公司)；580型鱼跃血糖仪及血糖试纸(江苏鱼跃医疗设备公司)。

针灸针(规格0.35 mm×13 mm，华佗牌)；BX53型显微镜(OLUMPUS公司)；DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40D型转移槽、WD-9413B型凝胶成像系统，北京六一公司；ELX-800型酶标仪(BIOTEK公司)；RM2235型石蜡切片机(Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 造模及分组 大鼠适应性喂养1周，随机选取13只作为空白组，其余53只作为造模组。造模组大鼠禁食12 h，一次性尾静脉注射现配的STZ柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.0，4 ℃)55 mg/kg，空白组大鼠注射等量柠檬酸缓冲液，72 h后大鼠尾尖采血测血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L则糖尿病造模成功[5]。经检测53只大鼠均成模,成模大鼠给予高糖高脂饲料(普通饲料、蔗糖、熟猪油、奶粉之比为55∶25∶15∶5)不规则喂养(单日上午，双日下午进食)8周，空白组大鼠给予普通饲料规则喂养8周。8周后随机选取空白组和造模组大鼠各3只，取材对相关指标进行检测，检验DGP建模是否成功。DGP模型成功标准[6]：①空腹血糖水平≥16.7 mmol/L；②造模组与空白组比较大鼠一般状况有明显差别；③胃排空率、小肠推进率比空白组降低显著。经检测DGP造模成功，将成模DGP大鼠随机分为模型组、针刺组、中药组、针药组和西药组每组10只，均给予普通饲料喂养。

1.4.2 处理方法 针刺组取“足三里”“三阴交”两穴，参照《实验针灸学》[7]确定位置，大鼠“足三里”位于后肢膝关节外侧下方当腓骨小头下约5 mm，“三阴交”位于后肢内踝尖直上10 mm。穴位处常规消毒，毫针直刺3 mm，留针30 min，每10 min行针1次，采用提插捻转手法，60～90次/min，两侧穴位交替使用；中药组按照大鼠和人体表面积换算法，每日给予益气健脾中药复方5 g/kg灌胃1次；针药组先给予中药复方5 g/kg灌胃再行针刺(操作同针刺组)；西药组每日给予多潘立酮3.15×10-3g/kg灌胃1次；空白组、模型组、中药组、西药组均在其他组针刺的同时进行抓取固定30 min，空白组、针刺组、模型组均每日给予0.9%氯化钠溶液10 mL/kg灌胃1次，各组共治疗4周。

1.4.3 标本采集 药物干预4周结束后，记录大鼠体质量及空腹血糖，然后大鼠禁食24 h，禁水2 h，5 mg/L酚红溶液2 mL灌胃，20 min后用20%乌拉坦按5 mL/kg腹腔注射麻醉处死大鼠。剖开腹部，结扎贲门和幽门，取出全胃置于冰上，沿胃大弯剪开胃体，取出胃内容物用以测胃排空率，在胃窦部沿矢状线取5 mm×5 mm大的胃组织多块，分装存于-80 ℃冰箱和4%多聚甲醛中用以做Western blot和免疫组化；游离小肠于幽门和回盲部剪断，平铺在冰上用以测小肠推进率。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 记录大鼠体质量、血糖及一般情况 每天观察各组大鼠精神状态、反应状况、活动量、进食量、毛色及大小便等变化情况，治疗结束后测体质量及空腹血糖。

1.5.2 胃排空率和小肠推进率检测 参照文献中的方法进行检测[8]，用蒸馏水充分冲洗胃内容物，定容为20 mL，加入0.5 mol/L氢氧化钠20 mL，搅拌均匀静置1 h，取5 mL上清液加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL去蛋白，3600 r/min离心10 min，取上清液，酶标仪560 nm波长下测定吸光度(OD)值。该OD值为实测酚红OD值：取试管按顺序加入5 mg/L酚红溶液2 mL，双蒸水18 ml，0.5 mol/L氢氧化钠20 mL，20%三氯乙酸溶液4 ml，混合均匀在560 nm波长下测定标准酚红OD值。胃排空率=(1-实测酚红OD值/标准酚红OD值)×100%。取出小肠铺直于冰上，测量幽门至酚红所到距离及幽门至回盲部全长：小肠推进率=(酚红在小肠中移行距离/小肠全长)×100%。

1.5.3 免疫组化法测定胃窦组织中RhoA、ROCK2含量 取4%多聚甲醛固定的大鼠胃窦组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋制备蜡块，切成5 μm的切片。按步骤脱蜡至水、抗原修复、3%过氧化氢孵育、山羊血清封闭，一抗(RhoA抗体、ROCK2抗体用PBS按1∶200稀释)4 ℃孵育过夜，二抗(HRP标记山羊抗兔IgG1∶500)37 ℃孵育60 min，DAB显色、复染、脱水、透明、封片，显微镜下采集图像，棕黄色及褐色颗粒状或片状物为阳性反应产物，采用Image-Pro Plus 6.0软件计算图像的OD值。

1.5.4 Western blot法测定胃窦组织中p-MYPT1、p-MLC蛋白表达 取-80 ℃冻存的大鼠胃窦组织100 g，按全蛋白提取试剂盒进行蛋白质提取、BCA蛋白浓度测定、蛋白定量、SDS-PAGE凝胶电泳(80V，2.5 h)、PVDF膜转印(80V，1.5 h)、5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗p-MLC(1∶500)、p-MYPT1(1∶600)、β-actin(1∶1000)4 ℃过夜，常规洗膜；二抗IgG-HRP(1∶5000)37 ℃孵育1.5 h，ECL发光显影。Image J软件进行灰度值分析，用目的蛋白与内参比值作为蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况

实验期间空白组大鼠精神状态佳、活动灵敏、反应正常，毛色有光泽且整洁，进食及大小便无明显改变。造模大鼠从第4周开始出现精神倦怠、活动减少、反应迟钝，毛色暗淡无光且杂乱；至第5周时出现大便质稀不成型，食量逐渐减少，腹部胀满。经过4周治疗后，各治疗组大鼠精神状态有所恢复，大便稀溏有所缓解，食量呈渐增趋势；模型组大鼠以上症状无缓解。

2.2 治疗后各组大鼠血糖、体质量比较

表1示，与空白组比较，模型组大鼠血糖显著升高，体质量显著减轻(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组血糖显著降低，体质量显著增加(P<0.05或P<0.01)；与针药组比较，针刺组、中药组及西药组血糖显著升高，体质量显著降低(P<0.05或P<0.01)；针刺组与中药组、西药组比较体质量变化无统计学意义(P>0.05)。

2.3 治疗后各组大鼠胃排空率及小肠推进率比较

表1示，与空白组比较，模型组胃排空率及小肠推进率显著下降(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组胃排空率及小肠推进率均显著升高(P<0.01)；与针药组比较，针刺组、中药组、西药组的胃排空率及小肠推进率均降低(P<0.05或P<0.01)，其中针刺组与中药组、西药组之间小肠推进率变化比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠治疗结束后血糖、体质量、胃排空率及小肠推进率比较

2.4 治疗后各组大鼠胃窦组织中RhoA、ROCK2蛋白阳性表达比较

图1～3示，空白组大鼠胃窦组织中棕褐色颗粒分布范围广且着色深，RhoA、ROCK2蛋白表达量多。与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织中棕褐色颗粒分布范围少且着色较淡，RhoA、ROCK2蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组RhoA、ROCK2蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01)；与针药组比较，针刺组、中药组、西药组大鼠胃窦组织中RhoA、ROCK2蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。

注：A.空白组；B.模型组；C.针刺组；D.中药组；E.针药组；F.西药组

注：A.空白组；B.模型组；C.针刺组；D.中药组；E.针药组；F.西药组

注：A.空白组；B.模型组；C.针刺组；D.中药组；E.针药组；F.西药组。与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与针药组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.5 治疗后各组大鼠胃窦组织中p-MYPT1、p-MLC蛋白表达水平比较

图4示，与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织中p-MYPT1、p-MLC蛋白相对表达量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组大鼠胃窦组织中p-MYPT1、p-MLC蛋白表达明显升高(P<0.01)，其中针药组优于针刺组、中药组和西药组(P<0.05或P<0.01)；针刺组与中药组之间p-MYPT1蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A.空白组；B.模型组；C.针刺组；D.中药组；E.针药组；F.西药组。与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与针药组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

DGP属于中医学“痞满、胃痞、反胃、胃缓”等范畴[9]。益气健脾中药复方是由香砂六君子汤加减化裁而来，考虑到糖尿病多为阴虚燥热所致，所以用性略偏寒的太子参易人参，与白术、茯苓、砂仁、木香、炙甘草共奏益气健脾、燥湿行滞、养阴和胃之功。方中去半夏、陈皮以防其辛燥太过伤及胃阴，加焦三仙、鸡内金以助其消食化滞、健脾和胃之职。因DGP病位主要在脾胃，按脏腑经脉的阴阳表里配伍关系，本研究选用表里经配穴法，取胃经“足三里”及脾经“三阴交”穴。《灵枢·邪气脏腑病形第四》中记载:“胃病者，腹月真胀……食饮不下，取之三里也。”足三里为胃病首选穴，可补中益气、消积除满、调理脾胃。三阴交穴具有健脾祛湿之功，主治腹胀、腹泻等脾胃虚弱诸证，又为足三阴经交会穴，可运化水液、益气养血，主阴虚诸证，两穴配伍共奏健脾和胃、益气养阴、化湿行滞之功。

现代医学对于DGP的发病机制尚不十分清楚。近年来研究显示，胃平滑肌病变在此病中占据核心地位，平滑肌细胞是负责产生胃肠道运动的最终效应器，胃排空功能主要受平滑肌收缩能力的影响。MLC(肌球蛋白轻链)磷酸化水平的高低决定着平滑肌细胞的收缩功能[10]。MLC的磷酸化受MLCK(肌球蛋白轻链激酶)和MLCP(肌球蛋白轻链磷酸酶)的影响，主要由钙敏化和钙依赖两条途径调节，其中钙敏化机制由RhoA/ROCK介导。

RhoA是Ras超家族中单体小分子G蛋白之一，RhoA活化后可以激活多种效应器，其在平滑肌组织中主要参与调控平滑肌细胞的收缩、运动和分裂等[11]。ROCK是丝/苏氨酸蛋白激酶家族的主要成员，目前被认为是RhoA重要的下游靶目标之一，ROCK包括ROCK1和ROCK2两种亚型,其中ROCK1主要在应力纤维的形成中起重要作用，ROCK2主要在细胞收缩中起重要作用[12]。在胃平滑肌组织中，被RhoA激活的ROCK2与MLCP的亚基MYPT1结合，对MYPT1的特定位点进行修饰，使其发生磷酸化，p-MYPT1的形成导致MLCP活性被抑制，使MLCP对已经磷酸化的MLC去磷酸化能力减弱，间接导致p-MLC的水平增高，进而促进胃平滑肌的收缩，加快胃排空，改善胃动力。

本研究结果显示，针药结合治疗能够显著增强胃平滑肌组织中RhoA、ROCK2、p-MYPT1、p-MLC的表达，改善DGP大鼠的一般状况，提高胃排空率及小肠推进率，促进胃肠动力，其机制可能与上调RhoA/ROCK/MLC信号通路的表达、促进胃平滑肌收缩有关。