基于代谢组学的电针对类风湿关节炎寒证模型家兔尿液内源性代谢物的影响

陈平，杜小正，王海东，田杰祥，李向军，袁博

基于代谢组学的电针对类风湿关节炎寒证模型家兔尿液内源性代谢物的影响

陈平1，杜小正2，王海东1，田杰祥3，李向军1，袁博3

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；3.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

通过分析类风湿关节炎寒证模型家兔尿液内源性代谢物，基于代谢组学探讨电针治疗类风湿关节炎的作用机制。将24只家兔随机分为正常组、模型组和电针组，每组8只，卵蛋白诱导联合低温冷冻制备类风湿关节炎寒证家兔模型。电针“足三里”，留针30 min，1次/d，共7 d。干预结束后收集新鲜尿液，气相色谱-四级杆飞行时间质谱采集家兔尿液代谢物图谱，结合多元统计方法分析数据；记录家兔膝关节周径，测定各组痛阈值，观察膝关节滑膜组织病理形态。与正常组比较，模型组家兔膝关节周径明显增大，痛阈值明显降低（＜0.05）；与模型组比较，电针组家兔膝关节周径明显减小，痛阈值明显升高（＜0.05）。模型组较正常组丙酮酸、乳酸、柠檬酸、花生四烯酸、牛磺酸、马尿酸、色氨酸及尿酸水平相对升高，甘氨酸、苯丙氨酸水平相对降低；电针组较模型组甘氨酸、苯丙氨酸水平上调，其余代谢物水平均下调。模型组较正常组滑膜组织滑膜衬里层细胞明显增生，层数增多，滑膜组织呈绒毛状，滑膜内可见微血管扩张、充血、水肿及炎性细胞浸润；电针组滑膜细胞增生层数较少，炎性细胞浸润程度及滑膜纤维组织增生程度较模型组明显减轻。电针可缓解膝关节肿胀，提高痛阈，改善滑膜组织病理形态，调节类风湿关节炎家兔机体能量代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢及嘌呤代谢。

电针；类风湿关节炎；代谢组学；气相色谱-四级杆飞行时间质谱；兔

代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，其研究生物体内相对分子质量较小的代谢物，对组织、细胞及体液中所有代谢产物进行定性和定量分析，为疾病诊治提供依据[1-2]。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎症和关节、软骨损坏为主要特征的多系统自身免疫疾病，其发病是多种因素共同作用的结果，这些因素导致RA相关代谢物水平发生变化[3]。通过代谢组学揭示RA发病过程中整体代谢物的改变，发现和筛选基于代谢物的特征性生物标志物，将有助于揭示RA发生发展及相关治疗的代谢机制[4]。基于此，本研究利用气相色谱-四级杆飞行时间质谱技术对RA寒证模型家兔尿液及电针干预后尿液代谢物差异进行探究，应用多变量统计方法对代谢产物进行模式识别，筛选重要的差异代谢物，并结合代谢通路分析，揭示RA疾病及电针干预后RA尿液整体性代谢的变化。

1 材料与方法

1.1 动物

2～3月龄健康普通级雄性新西兰家兔24只，体质量（2.5±0.5）kg，兰州生物制品研究所提供。饲养于温度（20±2）℃、相对湿度（50±10）%环境，每日光照时间12 h，自由摄食饮水。适应性饲养7 d，每周称重1次。

1.2 主要试剂与仪器

弗氏完全佐剂，美国Sigma公司，批号F5881；卵蛋白干粉，美国Sigma公司，批号A5253-250G。华佗牌SDZ-Ⅱ电针仪（苏州医疗用品厂有限公司），毛细管色谱柱（英国Agilent公司，HP-5ms），Agilent 7890A/5975C GC/MS系统（美国Agilent公司），显微镜（日本奥林巴斯，型号BX53）。

1.3 分组及造模

将24只家兔随机分为正常组、模型组和电针组，每组8只。采用卵蛋白诱导联合低温冷冻法制备RA寒证家兔模型[5-6]。

1.4 干预

电针组先将家兔用改良后兔台固定，选取“足三里”[7]。针刺8～12 mm，得气（针下沉紧）后接电针仪。电针参数：疏密波，强度1～2 mA，频率2 Hz/ 100 Hz，以能见到肌肉震颤、不出现嘶叫为度。每次30 min，每日1次，连续7 d。正常组和模型组不予针刺干预，只做与电针组相同的抓取、固定。

1.5 指标检测

1.5.1 样品采集

干预结束后，收集新鲜尿液，8000 r/min离心10 min，EP管收集上层尿液，-80 ℃冰箱保存，备检。

1.5.2 样品衍生化处理

尿液解冻，离心取上清液，加尿素酶后混合均匀，37 ℃反应15 min；加甲醇200 μL，置于温和氮气下吹干；加30 μL甲氧胺盐酸吡啶溶液（20 mg/mL），强烈震荡30 s，37 ℃肟化反应90 min；取出后加入BSTFA衍生试剂30 μL，70 ℃反应60 min，室温放置30 min，备检。

1.5.3 气相色谱-质谱条件

进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气（纯度＞99.999%）作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min升至320 ℃，维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测，检测范围为50～550 m/z。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动造成的影响。

1.5.4 膝关节周径测定

家兔膝关节股骨内外髁用记号笔标记固定两点，在固定点测量并记录膝关节周径。

1.5.5 痛阈检测

针刺结束后，用PL-200热刺痛仪照射兔耳部测痛点，以家兔出现挣扎缩耳作为疼痛反应信号，照射开始至家兔出现反应时间（s）作为痛阈值。连测3次，每次间隔5 min，取平均值。

1.5.6 膝关节滑膜组织病理观察

采集尿液后，空气栓塞法处死家兔，剥离滑膜组织，常规HE染色，显微镜观察滑膜组织形态。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 电针对模型家兔膝关节周径与痛阈的影响

与正常组比较，模型组家兔膝关节周径明显增大，痛阈值明显降低（＜0.05）；与模型组比较，电针组家兔膝关节周径明显减小，痛阈值明显升高（＜0.05）。见表1。

表1 各组家兔膝关节周径与痛阈值比较（±s）

注：与正常组比较，#＜0.05；与模型组比较，*＜0.05

2.2 电针对模型家兔膝关节滑膜组织病理形态的影响

模型组较正常组滑膜衬里层细胞增生，滑膜组织呈绒毛状，滑膜内可见微血管扩张、充血、水肿及炎性细胞浸润；电针组较模型组滑膜细胞增生、炎性细胞浸润及滑膜纤维组织增生均明显减轻。见图1。

2.3 模式识别

将编辑后数据导入SIMCA-P软件进行无监督PCA，数据矩阵空间分布各组有分开趋势，各组代谢模式有差异，见图2。采取有监督PLS-DA对数据进一步分析，显示各组所有样本可明显区分，见图3。

图1 各组家兔滑膜组织形态（HE染色，×100）

图2 各组家兔尿液PCA得分图

图3 各组家兔尿液PLS-DA图

采用PLS-DA模型VIP值（VIP＞1），并结合检验的值（＜0.05）寻找差异性表达代谢物。搜索在线数据库（https://metlin.scripps.edu/index.php）比较质谱精确分子质量，最终根据VIP值（VIP＞1）、分子量，并结合值，得出10种标志物（丙酮酸、乳酸、柠檬酸、花生四烯酸、甘氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、马尿酸、色氨酸、尿酸）。与正常组比较，模型组丙酮酸、乳酸、柠檬酸、花生四烯酸、牛磺酸、马尿酸、色氨酸及尿酸水平相对升高，甘氨酸、苯丙氨酸相对水平降低。电针组甘氨酸、苯丙氨酸水平较模型组上调，其余代谢物均下调。见表2。

表2 各组主要差异性代谢物相关系数比较

名称模型组/正常组电针组/模型组 丙酮酸上升下降 乳酸上升下降 柠檬酸上升下降 花生四烯酸上升下降 甘氨酸下降上升 牛磺酸上升下降 苯丙氨酸下降上升 马尿酸上升下降 色氨酸上升下降 尿酸上升下降

3 讨论

RA目前尚无特效疗法。研究显示，电针在改善症状、抗炎镇痛和免疫调节等方面均表现出较好疗效，可多水平、多环节和多途径控制RA的炎症反应[8-9]，但对RA相关代谢组学的作用机制尚缺乏探讨。

腧穴是影响针刺疗效的关键因素。足三里属补益穴之一，针刺该穴可扶正祛邪、舒经通络，对痹证有良好的止痛效应，且足三里部位肌肉相对丰厚，有利于电针操作。现代研究显示，电针佐剂性关节炎大鼠“足三里”可减轻足肿胀、关节症状评分及足组织炎症，降低踝关节骨组织Toll样受体4、髓样分化因子88和核因子-κB mRNA和蛋白的表达，显著降低关节炎评分、足和滑膜组织病理损伤，抑制模型大鼠滑膜血管生成，减少CD34阳性表达[10-11]。电针RA大鼠“足三里”可减轻炎症反应，改善其病理状态，降低膝关节滑膜组织p-JAK2和p-STAT3的表达，降低JAK2和STAT3 mRNA的表达[12]。

本实验结果显示，模型组家兔膝关节周径明显大于正常组，电针组家兔膝关节周径小于模型组。模型组家兔痛阈值低于正常组，电针组痛阈值高于模型组。模型组家兔膝关节可见明显病理改变，电针组较模型组明显减轻。模型组乳酸、柠檬酸、丙酮酸水平相对升高。乳酸水平升高提示机体无氧酵解异常加强；柠檬酸作为三羧酸循环的中间代谢产物之一，与机体对能量的需求密切相关，柠檬酸排泄增加，机体能量代谢加快[13]，其含量相对升高，提示RA体内糖有氧代谢部分加快。模型组花生四烯酸水平相对升高，花生四烯酸是机体的一种必需脂肪酸，是多种生物活性物质的前体，可通过环氧化酶途径和脂氧化酶途径分别代谢为前列腺素、血栓素和白三烯，在炎症和免疫反应中起重要调节作用[14]，其水平升高，提示RA存在炎症反应与免疫紊乱。模型组甘氨酸水平明显下降，甘氨酸是机体必需氨基酸，甘氨酸受体是一种良好的器官、组织和细胞保护剂，其作为一种重要的抑制性受体，分布在中性粒细胞、单核巨噬细胞、T淋巴细胞等细胞膜上，并参与体内免疫反应和炎症反应。甘氨酸与受体结合，可抑制中性粒细胞、单核巨噬细胞、T淋巴细胞活力及脂肪组织核因子-κB和促炎因子的表达，从而发挥抗炎作用[15]。模型组牛磺酸水平明显升高，牛磺酸作为一种抗氧化剂，可上调细胞中抗氧化防御系统，间接清除活性氧；还能降低机体细胞内Ca2+浓度，降低抗氧化应激反应程度，减少炎症因子释放，抑制氧化应激诱导的炎症反应以及RA的氧化应激[16]，其水平升高，提示RA氧化应激明显异常。模型组苯丙氨酸水平下调，马尿酸、色氨酸水平升高，苯丙氨酸是必需氨基酸，在肠道菌的作用下代谢成马尿酸，马尿酸进一步代谢成2-甲基马尿酸并通过尿液排出，色氨酸作为人体必需氨基酸，可抑制T细胞的增殖。模型组尿酸水平升高，尿酸是降解代谢嘌呤的终产物，能抑制自由基诱导的DNA损伤、清除自由基，可增加氧化应激标志物。

综上，电针可缓解膝关节肿胀，提高痛阈，改善病理形态，调节RA家兔机体能量代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢及嘌呤代谢。

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Effect of Electroacupuncture on Endogenous Metabolites in Urine of Rabbits with Cold Syndrome of Rheumatoid Arthritis Based on Metabonomics

CHEN Ping1, DU Xiaozheng2, WANG Haidong1, TIAN Jiexiang3, LI Xiangjun1, YUAN Bo3

To explore the metabolomics mechanism of electroacupuncture treatment for rheumatoid arthritis by analyzing the endogenous metabolites in urine of rabbits of rheumatoid arthritis with cold syndrome.A total of 24 rabbits were randomly divided into normal group, model group and electroacupuncture group, 8 rabbits in each group. Rheumatoid arthritis with cold syndrome rabbit model was made with egg protein induction and low temperature freezing method. Electroacupuncture group was applied to “” acupoint once a day for 30 minutes for 7 days. The fresh urine was collected and the urine metabolite profiles were collected by gas chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, and the data were statistically analyzed by multivariate statistical analysis method after the intervention; the knee joint circumference of rabbits was recorded; the pain threshold of each group was measured; the pathological changes of knee joint synovial tissue were observed.Compared with the normal group, the rabbit knee joint circumference in the model group significantly increased, and the pain threshold was significantly reduced (<0.05). Compared with the model group, the circumference of the knee joint of the rabbits in the electroacupuncture group was significantly reduced, and the pain threshold significantly increased (<0.05). Compared with the normal group, the levels of pyruvate, lactic acid, citric acid, arachidonic acid, taurine, hippuric acid, tryptophan and uric acid in the model group were relatively higher, while the levels of glycine and phenylalanine were relatively lower. Compared with the model group, the levels of glycine and phenylalanine increased, while the other metabolite levels decreased in the electroacupuncture group. Compared with the normal group, the synovial lining cells in the synovial tissue of the model group were significantly proliferated, the number of layers increased, the synovial tissue was villi-like, and microvascular expansion, hyperemia, edema and inflammatory cell infiltration were seen in the synovium; the electroacupuncture group had fewer synovial cell proliferation layers, and the degree of inflammatory cell infiltration and synovial fibrous tissue proliferation were significantly reduced compared with the model group.Electroacupuncture can relieve knee joint swelling, increase pain threshold, improve pathological changes of synovial tissue, regulate energy metabolism, fatty acid metabolism, amino acid metabolism and purine metabolism in rabbits of rheumatoid arthritis.

electroacupuncture; rheumatoid arthritis; metabonomics; gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry; rabbits

R245

A

1005-5304(2021)06-0070-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202009333

国家自然科学基金（81960832）；甘肃省高等学校科研项目（2016B-061）；兰州市科学技术局（2016-RC-50）

杜小正，E-mail：lz-duxiaozheng@163.com

2020-09-21）

2020-11-03；编辑：华强）