热休克蛋白HSPA1A促进肿瘤细胞增殖的研究

戚毓敏， 单 锴， 崔 静， 渠宏雁， 王 荣， 陈永泉*

（1.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

热休克蛋白（HSP）[1]通常可以在机体遭受应激时大量表达[2]，可以帮助细胞耐受外界环境压力，也称为热应激蛋白，具有高度保守性[3]。热休克蛋白通常根据相对分子质量大小进行分类，HSP70指的是相对分子质量在7×104左右的热休克蛋白，主要有HSPA1A、HSPA5、HSPA8、HSPA9。HSP70是热休克蛋白家族被研究较多的蛋白质之一[4]，也是其中表达量较高的热休克蛋白之一。HSP70主要起到分子伴侣作用，主要帮助蛋白质正确折叠，清除老旧或者受损的细胞[5]。HSP70主要存在于细胞质中，在细胞质中发挥保护细胞的作用[6]，如HSPA5定位于内质网，HSPA9则位于线粒体上起到细胞保护的作用。同时也有研究表明，氧化应激时HSP70，如HSPA8会进入细胞核中，发生核位移，在细胞核中起到保护细胞的作用。诱导型HSP70（HSPA1A），也称为HSP72[7]，在正常生理条件下表达量较低，在发生应激时，则会大量表达，HSPA1A主要通过应激诱导大量表达从而发挥作用。HSPA1A诱导后具有保护细胞的作用。例如，HSPA1A基因通过抑制核因子-κB（NF-κB）激活来抑制促炎细胞因子基因转录[8]，促炎细胞因子的下调保护细胞免受应激反应，防止细胞损伤或死亡从而保护机体免受应激伤害[9]。

恶性肿瘤是当下发病死亡率较高的疾病之一。恶性肿瘤的治疗是医学和生命科学的研究重点也是难点。肿瘤的主要特点就是肿瘤细胞无限制增殖，这种增殖是不受控的，因此抑制肿瘤细胞增殖是行之有效的肿瘤治疗方案之一。研究表明，在大多数肿瘤细胞中均可观察到HSPA1A蛋白水平的增加[10]，Sampson等[11]认为癌细胞拥有额外扩增的中心体，作者确定了一种新的途径，通过NIMA相关激酶6（NEK6）和HSPA1A促进中心体聚类。NEK6及其上游激活剂可以将HSPA1A靶向到具有扩增中心体的细胞极，因此NEK6-HSPA1A可以用于靶向具有扩增中心体的癌细胞，促进细胞增殖。Wan等[12]发现在体外建立非小细胞肺癌NCI-H1650的亚系，即用54℃热处理使其具有较高的耐热性，发现其比原来的细胞活力和增殖速率明显加快，通过Western Blot发现其HSPA1A表达量上调且用抑制剂VER155008（HSPA1A的抑制剂）能够抑制这种细胞的活力和增殖速率。这些说明HSPA1A与癌细胞增殖相关，因此推测HSPA1A可能在肿瘤细胞的生存和增殖中扮演着重要角色。

细胞增殖周期，是细胞从上一个有丝分裂结束到下一个有丝分裂结束的过程。有丝分裂包括分裂间期和分裂期，而分裂间期包括G1期、S期、G2期。G1期主要为DNA复制提供相关物质，G1期决定了细胞是否会发生分裂，若不发生分裂则走向G0期，因此G1期也被称为细胞周期的限制点。S期主要复制染色体，G2期主要为有丝分裂期。调节细胞周期的蛋白质主要有两类，它们相互配合，包括细胞周期蛋白，即cyclins；细胞周期蛋白依赖激酶，即CDKs，它们的相互作用能够共同调节细胞周期。如cyclin D1能够与CDK4/CDK6发生相互作用，从而使G1期的周期抑制蛋白——抑癌基因成视网膜瘤蛋白（Rb）发生磷酸化并从E2F转录因子上解离，E2F可以加速细胞的G1期，cyclin D1起到促进基因转录的功能；cyclin E1对应的周期蛋白激酶是CDK2，其可以与CDK2结合，起到作用与cyclin D1-CDK4/CDK6这条途径相同。研究表明cyclin通常在肿瘤发生中失调，如cyclin D1是一种原癌基因，推测其过度表达是细胞过度增殖并产生肿瘤的原因之一，目前已经在膀胱癌、淋巴癌、肺癌等多种癌症细胞中发现cyclin D1的过表达。cyclin E1同样也与肿瘤细胞的恶性增殖有关，如食管癌、胃癌、肝癌等多种癌症中发现cyclin E1增多，也有研究表明cyclin E1的持续过表达会导致G1期缩短。目前HSPA1A与周期相关蛋白以及激酶的关系尚不清楚。

作者主要探索HSPA1A对4种肿瘤细胞增殖的影响，并探究HSPA1A发挥作用的亚细胞定位以及对周期的影响。在此基础上，HSPA1A有望成为一个新的肿瘤治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

Forma371 CO2细胞培养箱、1300系列A2型生物安全柜、Attune NxT流式细胞仪、1510 Multican GO全波长酶标仪：购自Thermo（美国）有限公司；T-SAM倒置荧光显微镜：购自Nikon（日本）有限公司。

PRMI 1640完全培养基、DMEM高糖培养基、体积分数10%胎牛血清：购自Gibco（美国）有限公司；PI染色试剂盒：购自上海生工（上海）有限公司；转染试剂Lipofectamine 3000：购自Thermo（美国）有限公司。

HSPA1A、cyclin D1、CDK4、CDK6、cyclin E1、CDK2：购自Protein tech（中国）有限公司。

人结肠癌细胞系HT29、人非小细胞肺癌细胞A549、人宫颈癌上皮细胞HeLa、人前列腺上皮细胞PC3：购自中国科学院上海分院。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 轻轻吸去旧培养液，使用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS）洗1遍后，加入胰酶消化，然后加入完全培养基，吹打5次将细胞悬液移至新离心管中，200g离心5 min，弃去上清液。重新加入新鲜完全培养基，轻吹混匀，将细胞悬液根据所需密度分配在培养皿或多孔板中，补足新鲜完全培养基，将细胞放回细胞培养箱中培养3 d后传代。

1.2.2 细胞转染 细胞种板，约1 000个/孔。种板完成后12～24 h内完成细胞转染。准备无菌无酶EP管，配置转染体系，以96孔板为例，每孔加入5μL转染体系。转染体系配置：无血清培养基中加入质粒，按96孔板每个孔0.1μg加入质粒轻轻混匀，按每个孔0.3μL加入转染试剂，静置10 min。将配置的转染体系溶液加入孔板中，4 h后更换成完全培养基，继续培养24 h后，通过观察荧光判断转染效率，进行后续实验。

1.2.3 MTT 配置MTT储存液，质量浓度为5 mg/mL，溶液为PBS，避光溶解至无沉淀，用0.22μm无菌水系滤膜过滤除菌，避光保存。使用时，用无血清的培养基稀释至终质量浓度0.5 mg/mL，吸去孔板中原有的培养基，每孔加入100μL稀释的MTT工作液，继续培养4 h，此时底部会有紫色结晶。小心吸出孔内的MTT。每孔加入150μL二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪上低速振荡20 min，使结晶物充分溶解，在OD570nm处测量各孔的吸光度。

1.2.4 PI单染色法测细胞周期 转染过后培养48 h的细胞，用胰酶消化，200g离心5 min收集细胞。加入2 mL PBS重悬细胞，200g离心5 min进行清洗，加入70%（体积分数）的乙醇（PBS），4℃固定过夜。400g离心10 min，收集细胞去废液，PBS清洗。加入1 mL PI染液重悬细胞进行染色，冰上避光孵育45 min。流式细胞仪检测，通道为FL2。

1.2.5 Western Blot 配制SDS-PAGE胶，上样，每孔25μg蛋白质，设置90 V电压进行电泳，当条带分开至需要的位置，开始转膜，设置300 mA，冰上进行转膜（NC膜，GE）120 min；转膜结束，将膜放入含5 g/dL脱脂乳粉的TBST中，室温摇床封闭1 h。TBST洗膜3次，5 min/次，加入一抗4℃孵育过夜。吸出一抗，TBST清洗3次，5 min/次。加入相应二抗10 mL室温孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。配制发光液，凝胶成像仪显影成像。

1.2.6 免疫荧光 在12孔板中将处理结束的细胞爬片用预冷的PBS清洗，用4%（体积分数）的多聚甲醛在37℃培养箱中避光固定45 min，TBST清洗玻片5次，1 min/次，用含0.5%（体积分数）Triton X-100、5%（体积分数）FBS（PBS配制）的封闭液进行封闭打孔，室温避光封闭打孔45 min，弃去封闭液，将爬片从孔板中取出，放在载玻片上，滴加稀释好的一抗，完全覆盖爬片并放入湿盒，4℃过夜。弃去一抗，PBST清洗爬片5次，1 min/次。加荧光二抗至完全覆盖爬片，湿盒中室温避光孵育45 min，PBST清洗爬片5次，1 min/次，滴加DAPI避光孵育30 min，PBST清洗爬片5次，1 min/次。吸干爬片上的液体，用含抗淬灭剂的封片液封片，激光共聚焦观察。

2 结果与分析

2.1 过表达HSPA1A对癌细胞增殖的影响

采用作者所在实验室构建成功的HSPA1A大肠杆菌重组载体（含有GFP标签（非融合表达）的pEB），将质粒转染HeLa、HT29、PC3细胞，48 h后收集pEB细胞蛋白质，通过Western Blot验证能否在这3个细胞中表达成功，Western Blot显示HSPA1A在转染重组质粒的细胞中表达成功。

将验证过的质粒分别再次转染HeLa、HT29、PC3，转染24 h后拍摄细胞图片，48 h后进行MTT实验。24 h后通过细胞图片（见图1~图3）可以明显观察到瞬时转入HSPA1A质粒后癌细胞密度增加，细胞增殖加快。48 h后通过MTT实验可知转染后活细胞数目增多（见图4），进一步证明了HSPA1A能够加快肿瘤细胞的增殖。

图1 HeLa转染pEB空载（a）与HSPA1A（b）后的细胞形态Fig.1 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into HeLa

图3 PC3转染pEB空载（a）与HSPA1A（b）后的细胞形态Fig.3 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into PC3

图4 HeLa、HT29、PC3转染pEB空载与HSPA1A后48 h的细胞存活率Fig.4 Cell viability of HeLa,HT29,PC3 transfected pEB at no load(left)and HSPA1A(right)for 48 h

图2 HT29转染pEB空载（a）与HSPA1A（b）后的细胞形态Fig.2 Cell morphology after pEB (left)and HSPA1A(right)transferred into HT29

2.2 免疫荧光

为探究HSPA1A在肿瘤细胞中的亚细胞定位，进行免疫荧光实验。转染48 h后进行免疫荧光处理。pEB载体带GFP基因，因此转染成功的细胞带弥散性绿色荧光。HSPA1A蛋白用红色荧光标记，细胞核用DAPI进行染色。

转染HSPA1A后，红色荧光标记的HSPA1A停留于细胞质中，并未与细胞核重叠，可得出结论HSPA1A主要在肿瘤细胞的细胞质中发挥作用（见图5）。

图5 3种细胞转染pEB空载与HSPA1A的免疫荧光Fig.5 Immunofluorescence of three cells transfected pEB and HSPA1A

2.3 周期实验

由于细胞周期各阶段的DNA含量不同，而PI可以与DNA结合，因此其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。通过流式细胞仪检测PI荧光强度可以估计细胞内DNA含量继而确定细胞周期。

HT29细胞转染pEB空载后，位于G1期的细胞占所有细胞数目的比例为65.38%；位于G2期的细胞占所有细胞数目的比例为0.54%；位于S期的细胞占所有细胞数目的比例为34.08%。转染HSPA1A后位于G1期的细胞占所有细胞数目的比例为57.15%；位于G2期的细胞占所有细胞数目的比例为1.69%；位于S期的细胞占所有细胞数目的比例为41.16%（见图6）。

图6 HT29转染pEB空载（a）与HSPA1A（b）后的细胞周期Fig.6 Cell cycle after HT29 transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

HeLa细胞转染pEB空载后，位于G1期的细胞占所有细胞数目的比例为53.71%；位于G2期的细胞占所有细胞数目的比例为1.58%；位于S期的细胞占所有细胞数目的比例为44.72%。转染HSPA1A后位于G1期的细胞占所有细胞数目的比例为48.26%；位于G2期的细胞占所有细胞数目的比例为1.40%；位于S期的细胞占所有细胞数目的比例为50.34%（见图7）。

图7 HeLa转染pEB空载（a）与HSPA1A（b）后的细胞周期Fig.7 Cell cycle after HeLa transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

PC3细胞转染pEB空载后，位于G1期的细胞占所有细胞数目的比例为56.42%；位于G2期的细胞占所有细胞数目的比例为2.38%；位于S期的细胞占所有细胞数目的比例为41.20%。转染HSPA1A后位于G1期的细胞占所有细胞数目的比例为53.46%；位于G2期的细胞占所有细胞数目的比例为2.71%；位于S期的细胞占所有细胞数目的比例为43.83%（见图8）。

图8 PC3转染pEB空载（a）与HSPA1A（b）后的细胞周期图Fig.8 Cell cycle after PC3 transfection of pEB empty(left)and HSPA1A(right)

G1期称为DNA合成前期，由细胞周期实验可知HSPA1A过表达后，处于G1期的细胞明显变少。大多数细胞处于S期和G2/M期即DNA合成中后期。因此，过表达HSPA1A可以加速肿瘤细胞的G1期。

2.4 HSA1A对周期蛋白的影响

通过周期实验确定，HSPA1A能够加速细胞的G1期，推测可能是肿瘤细胞增殖加快的原因。为探究过表达HSPA1A以后对G1/S检查点相关的细胞周期蛋白（cyclin D1，cyclin E1）、细胞周期蛋白依赖激酶（CDK4、CDK6、CDK2）的影响，对3种肿瘤细胞进行转染，转染48 h后，收集细胞进行Western Blot。

结果表明过表达HSPA1A在细胞中可以促进cyclin D1、cyclin E1、CDK4、CDK6、CDK2的表达（见图9）。cyclin D1、cyclin E1、CDK4、CDK6、CDK2作为确定的G1/S检查点相关周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶，其表达量增多，可以帮助细胞周期加快。其 中HeLa细 胞 中CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E1明显增加，HT29中CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E1均发生明显上调，PC3中CDK4发生明显上调。推测HSPA1A可能促进cyclin D1和CDK4/CDK6的结合和（或）cyclin E1和CDK2的结合，HSPA1A作为伴侣蛋白质可能通过稳定cyclin D1-CDK4/CDK6和（或）cyclin E1-CDK2这两条途径中相关蛋白质，上调相应蛋白质含量，使细胞增殖加快。

图9 HSPA1A对周期蛋白相关蛋白质的影响Fig.9 Effect of HSPA1A on cyclins and CDKs

2.5 讨论

当细胞受到应激时，细胞中的应激诱导型HSP70发挥保护细胞的作用[13]。HSP70家族由几个高度同源的成员组成[14]，包括HSPA1A、HSPA5、HSPA8、HSPA9[15]。HSPA1A定位与细胞质和细胞核中[16]，HSPA5定位于细胞内质网上，是一个钙离子结合蛋白质，HSPA8蛋白质均匀分布于整个细胞，HSPA9作为线粒体伴侣蛋白质，主要定位于线粒体中[17]。有证据表明HSP70在癌症中过表达，这种伴侣蛋白质的高表达与肿瘤的产生和预后不良反应有关[18]。例如，HSP70过表达是早期肝细胞和前列腺癌的标志，也是大肠癌和乳腺癌晚期癌细胞结转移的标志之一[19]。

目前HSPA1A对细胞的增殖作用及相关机制尚未有明确的研究。已有的研究表明，外源性的HSPA1A可以促进肿瘤的生长。HSPA1A通过TLR2和TLR4信号传导促进H22肝癌细胞的增殖，推测HSPA1A充当TLR2和TLR4的内源性配体，以促进肿瘤生长[20]。

3 结 语

本研究发现HSPA1A可以促进PC3、HT29、HeLa这3种肿瘤细胞增殖。通过免疫荧光发现HSPA1A主要在细胞质中发挥增殖作用，PI染色发现HSPA1A主要加速了肿瘤细胞的G1期。在过表达HSPA1A后，发现G1/S检查点相关的周期蛋白和周期蛋白依赖激酶表达量均上调。肿瘤细胞中，基础氧化应激与蛋白质合成均有上调，HSPA1A作为伴侣蛋白质，可以帮助蛋白质正确折叠，同时稳定蛋白质构象。因此，肿瘤中高表达HSPA1A可能通过稳定cyclin D1-CDK4/CDK6和（或）cyclin E1-CDK2这两条途径中的相关蛋白质帮助细胞加速通过G1/S检查点。

HSPA1A能够有效促进癌细胞增殖，因此通过寻找靶向HSPA1A的药物有望抑制肿瘤细胞的增殖，对于临床肿瘤的治疗有重要作用。但是HSPA1A在细胞质中起到伴侣作用，以及在其他肿瘤细胞中的作用尚待研究。