豆粕源抗氧化肽的制备、鉴定与活性表征

潘风光， 蔡转章， 伍海波， 刘静波， 刘博群， 张 婷*

（1.吉林大学 食品科学与工程学院，吉林 长春130062；2.吉林大学 吉林省营养与功能食品重点实验室，吉林长春130062）

豆粕，是豆油加工的主要副产物，含有丰富的蛋白质，且80%以上为水溶性蛋白质[1]。然而在国内通常用于饲料加工，少部分用于发酵食品加工[2-3]，造成了极大的蛋白质资源浪费。研究表明，将豆粕进行酶解，可制备出具有良好生物活性的功能肽[4]，包括抗氧化肽[5-6]、血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽[7-8]、金属螯合肽[9-10]等，并且随着自由基理论的提出，天然抗氧化剂的需求量与日俱增[11]。因此，利用豆粕制备抗氧化肽，不仅能减少资源浪费，还能提高豆粕的附加值，在食品工业中具有广阔的应用前景。

目前国内外对于抗氧化肽的研究，仅局限于制备和活性检测，以及肽序列的鉴定及表征[12-14]层面。HE Shudong等[15]使用胰蛋白酶水解假鲍鱼制备抗氧化肽，并鉴定得到八肽序列DTETGVPT；WANG Xueqin等[16]经过分离纯化太平洋鲱鱼抗氧化肽，鉴定出LHDELT和KEEKFE 2条六肽序列；SHENG Jianyong等[17]从脱脂核桃中鉴定得到序列为DWMH的抗氧化肽。多肽结构与其抗氧化活性之间有着密切关系，因此鉴定抗氧化肽的序列结构是揭示构效关系的基础，也是后续定向大规模生产应用的前提。

本研究中以大豆粕为原料，采用超声辅助酶解法制备抗氧化肽并优化制备工艺，利用超滤进行分离纯化获得相对分子质量<1 000组分，应用LCMS/MS确证高活性组分中肽序列，最后合成上述肽序列进行活性表征。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕：市售；碱性蛋白酶：长春市天佳生物技术有限公司产品；氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：北京化工厂制造；过硫酸钾：天津市华东试剂厂制造；ABTS、Trolox、AAPH、荧光素钠：美国Sigma-Aldrich公司产品；甲酸、乙腈：美国Fisher Scientific公司产品；羟自由基测定试剂盒：南京建成有限公司产品。

1.2 仪器与设备

Starter2C pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；SynergyHT酶标仪：BioTek公司产品；CR20B2高速冷冻离心机：日立有限公司产品；XX8200230小型切向流超滤系统：Millipore有限公司产品；FD-1C-50冻干机：北京博医康实验仪器有限公司产品；Orbitrap Elite高场静电场轨道离子肼质谱仪：美国Thermo Scientific公司产品。

1.3 方法

1.3.1 豆粕酶解工艺 将豆粕进行粉碎并经60目筛子筛分，得到豆粕粉用于后续实验：

豆粕粉+蒸馏水→超声处理→90℃变性10 min→酶解（保持温度及pH波动范围在±0.1）→90℃灭酶10 min→4℃、4 000 r/min离心20 min→取上清液。

1.3.2 豆粕抗氧化肽制备单因素实验 按照上述步骤，分别考察酶解条件及超声条件对制备豆粕抗氧化肽的活性影响，以ABTS自由基清除率为评价指标，如表1所示。在各单因素条件下，其他因素条件均选择中间条件，若条件已得到优化，则选择最优条件。

表1 单因素设计因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor design

1.3.3 豆粕抗氧化肽制备响应面实验 根据单因素实验结果，选取温度、加酶量、超声功率和超声时间进行Box-Behnken Design（见表2）。

表2 响应面设计因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.3.4 豆粕抗氧化肽的鉴定 通过超滤处理获得相对分子质量<1 000的组分进行LC-MS/MS鉴定。色谱条件：使用C18色谱柱（100μm×2 cm，4μm）；流动相：A相为0.1%（体积分数）甲酸水，B相为含0.1%（体积分数）甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱：0~60 min，5%~35%B；60~64 min，35%~75%B；64~74 min 75%B；流量为300 nL/min。质谱条件：纳米ESI源；采用数据依赖性采集模式，先在FT模式下以60 000的分辨率进行全MS扫描，然后对初始MS扫描中的15种最丰富离子进行CID MS/MS扫描。

1.3.5 豆粕源抗氧化肽的合成 委托生工生物工程股份有限公司进行合成，纯度达98%。

1.3.6 体外抗氧化活性测定

1）ABTS自由基清除能力 参照Heeger等[18]的实验方法稍做改动。实验分组：空白组（200μL PBS），对照组（180μL ABTS工作液+20μL PBS），实验组（180μL ABTS工作液+20μL样品）。实验结果以ABTS自由基清除率表示，计算公式如下：

式（1）中：Ac为对照组吸光度，As为实验组吸光度，Ab为空白组吸光度。

2）氧自由基吸收能力 参照ZHENG Li等[19]的实验方法并略做改动。实验分组：空白组（120μL荧光素钠+20μL PBS+60μL AAPH），对照组（120μL荧光素钠+20μL Trolox+60μL AAPH），实验组（120μL荧光素钠+20μL样品+60μL AAPH）。相邻2个测定点的时间间隔为2 min，每次读数前振板10 s，连续测定10 h。实验结果以ORAC值（mg TE/mg）表示，计算公式如下：

式（2）中：netAUC为对应样品保护面积，M为对应样品质量浓度，mg/mL。

式（3）中：AUC为对应样品的荧光衰退曲线面积。

式（4）中：f0为初始0 min时的荧光强度，fi为第i个测定点的荧光强度。

3）羟自由基清除能力 按照试剂盒说明书进行操作，实验结果用羟自由基清除率表示，计算公式如下：

式（5）中：Ac为对照组吸光度；As为实验组吸光度；Ab为空白组吸光度。

1.4 数据分析

数据组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），结果以P<0.05为显著性差异判断标准。

2 结果与分析

2.1 豆粕抗氧化肽的单因素实验

酶解条件主要通过改变酶活性[20-21]来影响酶解反应，从而导致酶解产物的抗氧化能力不同。由图1（a）可知，随着pH增大，清除率逐渐增大，在pH为11.0时达到最大值，但通过显著性分析，在pH为8.0~11.0时，清除能力并没有太大差异，因此选择8.0为最优pH，此条件更接近中性，不仅能降低成本还能减少后续处理工作量。随着底物质量分数增加，清除率亦呈现出不断增大的趋势，当底物质量分数超过9%后，底物过量，酶解速率已达到最大，此时产物生成速率相对稳定，产物抗氧化活性也趋于稳定。加酶量的趋势变化与底物质量分数一致，当加酶量为7 000 U/g时达到峰值，此后继续增大酶量，底物不足，酶解体系达到平衡，酶解产物较为稳定，因此抗氧化能力也达到稳定。而随着温度升高，清除率先增大后减小，在40℃时清除率最大，之后继续升温，酶结构被破坏，酶活性降低[22]，导致产物生产速率减小，抗氧化能力减弱。酶解时间与酶解温度的变化趋势相似，刚开始反应时间过短，具有抗氧化活性的氨基酸残基没有被充分暴露出来[23]，随着时间的延长，酶解产物逐渐增多，抗氧化能力增大。4 h后，清除率出现减小，推测可能是反应时间过长，产物之间发生聚集效应[24]，导致活性位点被掩盖，抗氧化能力减弱。

图1 酶解条件对抗氧化能力的影响Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on antioxidant capacity

适当的超声处理，对于豆粕蛋白质溶出具有促进作用，并且可改变豆粕蛋白质的空间结构，使得豆粕蛋白质与酶更容易结合[25]。但底物毕竟有限，当超声时间和功率达到一定范围后，再延长时间及增大功率并不能溶出更多的豆粕蛋白质，还可能破坏豆粕蛋白质的分子构象，导致酶解产物的抗氧化能力降低（见图2）。可见，只有适宜的超声处理才有利于酶解反应的进行[26]，并使得豆粕肽表现出良好的抗氧化能力。

图2 超声条件对抗氧化能力的影响Fig.2 Effect of ultrasonic conditions on antioxidation resistance

2.2 豆粕抗氧化肽的响应面实验

根据单因素实验结果，选取温度（A）、加酶量（B）、超声功率（C）和超声时间（D）4个因素为自变量，以ABTS自由基清除率为响应值（Y），进行Box-Behnken Design，所得结果如表3、图3所示。其他未考察单因素均为单因素优化得到的最优条件。

图3 各因子交互作用的曲面图和等高线图Fig.3 Surface map and contour maps for each factor interaction

如表3所示，模型具有极显著性（P<0.01），因变量与自变量之间的线性关系显著（R2=0.966 5），并且失拟项（P>0.05）差异不显著，说明该模型拟合程度良好，所得到的回归方程可信度较高。回归方程：Y=-172.487 02+0.026 556C-1.871 66×10-3AC-0.451 87AD-0.010 954A2-6.406 53B2-1.167 9×10-4C2-0.864 79D2+2.480 67×10-6AC2+0.017 045AD2-6.795 94×10-4CD2。

表3 回归模型方差分析及回归方程系数显著性检验Table 3 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models

通过模型预测得到最佳工艺条件为：温度50℃，加酶量6 665.39 U/g，超声功率300 W，超声时间9 min，此时模型指标值为16.01%。为检验响应面法的可行性，采用所得最佳工艺条件进行验证实验，得到ABTS自由基清除率为（15.70±0.06）%，实际值与预测值的误差小于1%，因此利用响应面法对豆

粕抗氧化肽的制备条件优化是可行的，得到的工艺参数具有实际应用价值。通过与前人研究[27]相比，本实验中所得的pH和温度更低、加酶量更少、超声时间更短，在实际应用中，能有效降低生产成本。

续表3

2.3 豆粕抗氧化肽的鉴定

大量的研究结果表明[28-30]，当相对分子质量较大时，部分活性基团仍存在于大分子聚集体的内部，导致抗氧化能力降低[31]，因此本实验直接超滤得到相对分子质量<1 000的组分进行LC-MS/MS鉴定。结合软件分析及蛋白质数据库（UniProt），确定出氨基酸序列为Ile-Trp-Asn-Leu-Asn（IWNLN），位于大豆蛋白质（B2ZF64-1）的639~643残基位置，其相对分子质量为658.75，等电点是6.06，平均亲水性-1.3，疏水性较强。如图4（a）所示，通过CID碰撞断裂所产生的bn与yn离子系列，除b1、y1离子外，其他离子均成功匹配，匹配度较高。

图4 IWNLN的二级质谱图和结构式Fig.4 MS/MS and structure formula of IWNLN

2.4 豆粕抗氧化肽的活性表征

由图5（a）可知，3种样品对ABTS自由基清除能力均呈现出质量浓度依赖性，通过计算，IWNLN的IC50为（0.060±0.003）mg/mL，豆粕抗氧化肽粗提液与豆粕抗氧化肽（相对分子质量<1 000）的IC50分别为（0.412±0.022）mg/mL和（0.338±0.005）mg/mL。IWNLN之所以具有较强的ABTS自由基清除能力，是因为IWNLN上具有疏水性氨基酸Ile和Trp，当存在于非极性的N端时可增强抗氧化活性[32-33]，且Trp的侧链上含有吲哚基，具有供氢能力，可减缓或终止自由基的链式反应[34]。

图5 （b）和图5（c）为氧自由基吸收能力，由图可知，在初始质量浓度同为0.01 mg/mL时，3种样品的抗氧化能力均比Trolox强，其中IWNLN活性最强，ORAC值可达（7.614±0.138）mg TE/mg。这是由于IWNLN上有芳香族氨基酸Trp，在ORAC反应中，易失去氢原子而与自由基发生反应，并且Trp还与Asn相连，可产生共轭效应[35-36]，使得氢质子更易释放。

如图5（d）所示，3种样品对羟自由基清除能力均呈现出剂量效应，经过计算，3种样品的IC50分别是（0.051±0.002）、（0.038±0.001）mg/mL和（0.008±0.001）mg/mL。研究表明，芳香族氨基酸和疏水性氨基酸因其特殊的结构，具有非常强的自由基清除能力[37]，而五肽IWNLN上不仅具有芳香族氨基酸Trp，还具有疏水性氨基酸Ile和Leu，占整个肽序列的3/5，因此IWNLN具有较强的羟自由基清除能力。

图5 豆粕抗氧化肽的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of soybean meal antioxidant peptides

3 结 语

以ABTS自由基清除率为主要评价指标，通过单因素和响应面实验确定了采用超声辅助酶解法制备大豆抗氧化肽的最优工艺参数为：酶解pH 8.0、底物质量分数9%、加酶量6 665.39 U/g、酶解温度50℃、酶解时间4.0 h、超声时间9 min、超声功率300 W。经过超滤处理，获得相对分子质量<1 000的组分进行LC-MS/MS鉴定，获得豆粕源抗氧化肽Ile-Trp-Asn-Leu-Asn（IWNLN），其ABTS自由基清除能力的IC50值为（0.060±0.003）mg/mL，ORAC值为（7.614±0.138）mg TE/mg，羟自由基清除能力的IC50值为（0.008±0.001）mg/mL。研究表明，豆粕源肽IWNLN具有明确的结构和良好的抗氧化活性，可作为抗氧化功能因子为豆粕抗氧化肽功能食品开发提供新的思路。