lncRNA UCA1通过激活miR-143/HK2通路促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、侵袭和EMT

张永红，李存涛，张玉红，姚丽

郑州大学附属郑州中心医院皮肤科，河南 郑州 450000

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是一种源自表皮角质形成细胞的皮肤肿瘤［1］，大部分患者在诊断时已发展为侵袭性CSCC［2］。这些高转移性疾病的长期预后非常差，疾病特异性生存率为44.56%。因此，寻找新的诊断生物标志物，从而提高CSCC的治疗效果迫在眉睫。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码调控RNA［3］。研究表明lncRNA在染色体失活、基因组印记和发育等生物学过程中发挥调控作用［4-5］。最近，越来越多的报道显示许多失调的lncRNA参与了人类癌症的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和转移［6-7］。例如，lncRNA PVT1高表达在食管癌中通过诱导EMT促进侵袭［8］，而lncRNA PANDAR表达升高对结直肠癌预后不良，并通过EMT途径促进转移［9］。UCA1首次被确定为膀胱癌的致癌lncRNA。UCA1在乳腺癌、胰腺癌、胃癌和结直肠癌等多种癌症中高表达［10-11］，提示UCA1的高表达可能是预测这些癌症转移和预后的分子标记。一些研究也表明UCA1的上调与乳腺癌和膀胱癌的EMT相关，但UCA1在CSCC中的表达及其潜在机制仍不清楚。本研究旨在探讨lncRNA UCA1对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的表达及其对癌细胞增殖、侵袭及其EMT的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

40例CSCC和28例癌旁正常组织标本均来自本院，收集的标本经患者同意和本单位伦理委员会批准，保存在液氮中用于后续实验。人皮肤鳞癌细胞(A431细胞)和人正常皮肤细胞(HaCaT细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒来自美国Abcam公司；改良Eagle培养基(Dulbecco＇s Modified Eagle Medium，DMEM)为美国Gibco公司产品、长链非编码RNA UCA1下调质粒(UCA1 siRNA)；长链非编码RNA UCA1过表达质粒(pcDNA-UCA1)、miR-143抑制剂(miR-143 inhibitor)、miR-143模拟物(miR-143 mimics)、己糖激酶Ⅱ下调质粒(HexokinaseⅡsiRNA，HK2 siRNA)等由Genepharma公司合成；钙粘附蛋白E(E-cadherin)、钙粘附蛋白N(N-cadherin)、GAPDH多克隆抗体购自上海碧云天生物科技有限公司；Turbofect为美国Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养A431细胞和HaCaT细胞，各组细胞放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，细胞培养基每2 d更换1次，长满后及时消化细胞。

1.2.2 细胞转染用10%FBS的DMEM稀释长满的细胞，接种于12孔板，观察细胞生长至约70%时，用无血清的DMEM培养基覆盖细胞单层，利用Turbofect转染试剂，按照说明书进行质粒转染，按实验要求，所有细胞在37℃、5% CO2的培养箱中孵育一定时间后，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.3 细胞活力测定将各组细胞按4×103/孔的密度接种至96孔板中，各组质粒转染至细胞48 h后，吸去每孔培养基，用PBS洗涤3次，每孔加入20μL MTT，在37℃培养箱孵育4 h后，吸去上清液，每孔细胞中加入150μL DMSO，在37℃摇床中充分摇动10 min，在酶标仪下读取490 nm处的吸收峰。

1.2.4 双荧光素酶报告基因活性检测首先构建lncRNA UCA1 wt载体和HK2 wt载体，利用点突变试剂盒突变质粒，构建lncRNA UCA1 mut和HK2 mut载体。A431细胞稀释并接种于12孔板，观察细胞密度为70%～75%时，将lncRNA UCA1 wt、lncRNA UCA1 mut分别与miR-143 mimics、mimics NC质粒，HK2 wt、HK2 mut分别与miR-199a-5p mimics、mimics NC质粒共转染至A431细胞，48 h后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性。

1.2.5 细胞侵袭实验用Turbofect将质粒转染至A431细胞48 h后，重悬细胞并制成细胞悬液，预先加入100μL基底胶(Matrigel)于Transwell上室中，再将1×105个稀释后的细胞加入其中，下室中加入600μL完全DMEM培养基，24 h后取小室，加入4%多聚甲醛固定细胞，吸去固定液后加入PBS洗涤3次，加入0.1%结晶紫染色20 min，随机选取计数5个视野中的细胞数观察并计数。

1.2.6 实时定量PCR收集各组细胞，加入Trizol提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix)将细胞总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行RT-qPCR，用StepOnePlus实时PCR系统(Thermo Fisher)检测PCR产物，每组设置3个复孔，GAPDH为内参。实验所用的引物见表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.7 Western blot用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime)在酶标仪中测定蛋白浓度。加入上样缓冲液变性10 min后，取50μg蛋白样品进行SDS-PAGE，再转移到PVDF膜上；用封闭液(5%脱脂奶粉)将膜封闭2 h，TBST洗涤3次，分别加入特异性一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后加入二抗，室温摇床孵育2 h，膜清洗干净后进行蛋白曝光，应用Image J软件对膜上蛋白质条带的灰度值进行检测分析，实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理数据，实验数据用平均数±标准差表示，至少取3次独立实验结果。lncRNA UCA1 siRNA与siRNA NC，HK2 siRNA与siRNA NC，miR-143 inhibitor与inhibitor NC等两组间比较采用配对t检验；mimics NC+UCA1 wt组和UCA1 wt+miR-143 mimics组、mimics NC+UCA1 mut组和UCA1 mut+miR-143 mimics组、mimics NC+HK2 wt组和HK2 wt+miR-143 mimics组、mimics NC+HK2 mut组和HK2 mut+miR-143 mimics组等两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调lncRNA UCA1抑制A431细胞的增殖、侵袭及EMT

RT-qPCR结果显示，lncRNA UCA1在皮肤鳞状细胞癌中表达量为2.89±0.46，在癌旁正常组织中表达量为1.23±0.72，两者比较差异具有统计学意义(t=20.65，P=0.002)；A431细胞中的lncRNA UCA1表达量为1.86±0.52，HaCaT细胞中为0.94±0.38，两者比较差异具有统计学意义(t=22.06，P=0.002)。lncRNA UCA1 siRNA、siRNA NC组细胞内UCA1表达量分别为0.45±0.73和1.12±0.38，表明lncRNA UCA1 siRNA质粒转染成功。UCA1 siRNA组A431细胞增殖能力明显低于siRNA NC组(t=25.78，P=0.001)；与siRNA NC组相比，UCA1 siRNA组Ncadherin蛋白表达量明显降低(t=18.74，P=0.004)，E-cadherin蛋白表达量明显上升(t=23.58，P=0.001)；与siRNA NC组相比，UCA1 siRNA组细胞侵袭数目明显减少(t=19.75，P=0.003)。见图1A～1C。

图1 下调lncRNA UCA1抑制A431细胞的增殖、侵袭及EMT 1A：MTT法检测下调lncRNA UCA1对A431细胞增殖的影响；1B：Western blot实验检测下调lncRNA UCA1对A431细胞EMT的影响；1C：Transwell检测下调lncRNA UCA1对A431细胞侵袭的影响Figure 1 Down-regulation of lncRNA UCA1 inhibits proliferation，invasion and EMT of A431 cells．1A：The effect of down-regulation of lncRNA UCA1 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；1B：Western blot was used to detect the effect of down-regulating lncRNA UCA1 on EMT of A431 cells；1C：The effect of down-regulating lncRNA UCA1 on the invasion of A431 cells was detected by transwell．

2.2 lncRNA UCA1与miR-143之间的关系

图2为miRanda预测的UCA1和miR-143之间的结合位点。与mimics NC+UCA1 wt组相比，UCA1 wt+miR-143 mimics组细胞的荧光素酶活性明显降低(t=28.41，P=0.001)；与mimics NC+UCA1 mut组相比，UCA1 mut+miR-143 mimics组细胞的荧光素酶活性无明显变化(t=0.97，P=0.434)。RT-qPCR结果显示：UCA1 siRNA组细胞内miR-143表达量明显高于siRNA NC组(1.82±0.45比0.97±0.36，t=12.26，P=0.006)；pcDNA-UCA1组细胞内miR-143表达量明显低于pcDNA-3.1(+)组(0.37±0.26比0.98±0.34，t=11.52，P=0.007)，表明lncRNA UCA1与miR-143之间具有负调控关系。

图2 预测lncRNA UCA1与miR-143之间的结合位点Figure 2 Prediction of binding sites between lncRNA UCA1 and miR-143．

2.3 下调miR-143促进A431细胞的增殖、侵袭及EMT

RT-qPCR结果显示，皮肤鳞状细胞癌中miR-143表达量为0.45±0.34，癌旁正常组织中为1.05±0.92，两者比较差异具有统计学意义(t=13.60，P=0.006)；A431细胞中的miR-143表达量为0.56±0.76，HaCaT细胞中为1.24±0.37，两者比较差异具有统计学意义(t=11.68，P=0.007)。miR-143 inhibitor、inhibitor NC组细胞内miR-143表达量分别为0.37±0.79和1.04±0.34，两者比较差异具有统计学意义(t=17.46，P=0.003)。miR-143 inhibitor组A431细胞增殖能力明显高于inhibitor NC组(t=19.80，P=0.002)；与inhibitor NC组相比，miR-143 inhibitor组E-cadherin蛋白表达量明显降低(t=20.06，P=0.002)，N-cadherin蛋白表达量明显上升(t=18.82，P=0.002)；与inhibitor NC组相比，miR-143 inhibitor组细胞侵袭数目明显增加(t=15.53，P=0.004)，见图3A～3C。

图3 下调miR-143促进A431细胞的增殖、侵袭及EMT 3A：MTT法检测下调miR-143对A431细胞增殖的影响；3B：Western blot实验检测下调miR-143对A431细胞EMT的影响；3C：Transwell检测下调miR-143对A431细胞侵袭的影响Figure 3 Down-regulation of miR-143 promotes proliferation，invasion and EMT of A431 cells．3A：The effect of downregulation of miR-143 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；3B：The effect of down-regulating miR-143 on EMT of A431 cells was detected by Western blot assay；3C：Effect of down-regulation of miR-143 on A431 cell invasion was detected by transwell．

2.4 上调lncRNA UCA1通过miR-143促进A431细胞的增殖、侵袭及EMT

RT-qPCR结果显示，pcDNA-3.1(+)、pcDNA-UCA1组的UCA1表达量分别为1.19±0.86和2.46±1.27，二者比较差异有统计学意义(t=18.38，P=0.002)。pcDNA-UCA1+mimics NC组A431细胞增殖能力和侵袭数目明显高于pcDNA-3.1(+)+mimics NC组(t值分别 为20.98、23.27，P值均＜0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics组细胞增殖能力和侵袭数目明显低于pcDNA-3.1(+)+mimics NC组(t值 分 别 为7.06、20.79，P值均＜0.01)，pcDNA-UCA1+miR-143 mimics组细胞增殖能力和侵袭数目明显高于pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics组(t值分别为16.72、6.03，P值均＜0.01)，见图4A、4B。与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比，pcDNAUCA1+mimics NC组N-cadherin蛋白表达量明显上升(t=13.35，P=0.006)，E-cadherin蛋白表达量明显下降(t=24.20，P=0.002)，pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics组E-cadherin蛋白表达量明显上升(t=14.12，P=0.005)，N-cadherin蛋白表达量明显下降(t=13.79，P=0.005)；与pcDNA-3.1(+)+miR-143 mimics组相比，pcDNAUCA1+miR-143 mimics组N-cadherin蛋白表达量明显上升(t=30.14，P=0.001)，E-cadherin蛋白表达量明显下降(t=23.48，P=0.002)，见图4C。

图4 上调lncRNA UCA1通过miR-143促进A431细胞的增殖、侵袭及EMT 4A：Transwell检测上调lncRNA UCA1通过miR-143对A431细胞侵袭的影响；4B：MTT法检测上调lncRNA UCA1通过miR-143对A431细胞增殖的影响；4C：Western blot实验检测上调lncRNA UCA1通过miR-143对A431细胞EMT的影响Figure 4 Upregulation of lncRNA UCA1 promotes proliferation，invasion and EMT of A431 cells through miR-143．4A：Transwell was used to assess the effect of upregulation of lncRNA UCA1 on A431 cell invasion through miR-143；4B：The effect of upregulation of lncRNA UCA1 through miR-143 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；4C：Western blot was used to detect the effect of upregulated lncRNA UCA1 on EMT of A431 cells through miR-143．

2.5 miR-143与HK2之间的关系

利用TargetScan预测miR-143与HK2的结合位点结果见图5。与mimics NC+HK2 wt组相比，HK2 wt+miR-143 mimics组细胞的荧光素酶活性明显降低(t=18.38，P=0.003)；与mimics NC+HK2 mut组(1.14±0.04)相比，HK2 mut+miR-143 mimics组(1.18±0.26)细胞的荧光素酶活性无明显变化(t=3.60，P=0.069)。RT-qPCR结果显示，miR-143 inhibitor组细胞内HK2表达量明显高于inhibitor NC组(2.13±0.45比1.06±0.28，t=22.15，P=0.002)，miR-143 mimics组细胞内HK2表达量明显低于mimics NC组(0.29±0.37比1.13±0.45，t=19.79，P=0.003)，表明miR-143与HK2之间具有负调控关系。

图5 预测miR-143与HK2之间的结合位点Figure 5 Prediction of binding sites between miR-143 and HK2．

2.6 下调HK2对A431细胞的增殖、侵袭及EMT的影响

RT-qPCR结果显示，A431细胞中的HK2表达量(2.36±0.47)高于HaCaT细胞(1.14±0.34)，两者比较差异有统计学意义(t=26.31，P=0.001)。siRNA NC、HK2 siRNA组A431细胞中HK2表达量分别为1.06±0.38和0.32±0.27，两者比较差异有统计学意义(t=20.55，P=0.002)。

HK2 siRNA组A431细胞增殖能力明显低于siRNA NC组(t=8.90，P=0.012)。与siRNA NC组相比，HK2 siRNA组N-cadherin蛋白表达量明显降低(t=14.94，P=0.005)，E-cadherin蛋白表达量明显上升(t=16.12，P=0.004)；HK2 siRNA组细胞侵袭数目明显减少(t=13.79，P=0.005)。见图6A～6C。

图6 下调HK2抑制A431细胞的增殖、侵袭及EMT 6A：MTT法检测下调HK2对A431细胞增殖的影响；6B：Western blot实验检测下调HK2对A431细胞EMT的影响；6C：Transwell检测下调HK2对A431细胞侵袭的影响Figure 6 Down-regulation of HK2 inhibits proliferation，EMT，and invasion of A431 cells．6A：The effect of down-regulation of HK2 on proliferation of A431 cells was detected by MTT assay；6B：Western blot was used to detect the effect of down-regulating HK2 on EMT of A431 cells；6C：The effect of down-regulating HK2 on the invasion of A431 cells was detected by Transwell．

2.7 lncRNA UCA1通过miR-143上调HK2表达

UCA1 siRNA+inhibitor NC组HK2表达量明显低于siRNA NC+inhibitor NC组(0.65±0.04比1.25±0.52，t=21.61，P=0.002)；siRNA NC+miR-143 inhibitor组HK2表达量明显高于siRNA NC+inhibitor NC组(2.75±0.52比1.25±0.52，t=21.61，P=0.002)；UCA1 siRNA+miR-143 inhibitor组HK2表达量明显低于siRNA NC+miR-143 inhibitor组(1.36±0.21比2.75±0.52，t=25.81，P=0.002)。

3 讨论

越来越多的报道显示，lncRNAs表达异常与包括CSCC在内的多种人类癌症的病理发展密切相关。如研究表明lncRNA XLOC_001659在食管癌组织中表达上调，敲除lncRNA XLOC_001659可抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭［12］。lncRNA DLX6-AS1通过靶向miR-16-5p/NUCKS1调控CSCC细胞A431增殖、迁移和侵袭［13］。UCA1在癌症中是一个敏感、特异性的致癌lncRNA，在各种癌症中表达上调，UCA1的高表达参与了许多癌症的细胞侵袭和迁移，本研究结果与有关UCA1在胰腺癌细胞、骨肉瘤细胞、非小细胞肺癌等癌症中表达的研究结果一样［14-15］，UCA1在CSCC组织和细胞中表达升高。UCA1的异常表达提示UCA1与CSCC的发展密切相关。EMT是一个很好的特征过程，它促进了人类癌症的侵袭和转移扩散。本研究结果显示，UCA1敲低能够抑制A431细胞的增殖和侵袭，导致E-cadherin升高，N-cadherin降低，而UCA1过表达导致相反结果。提示UCA1可能通过促进EMT来调节CSCC的晚期侵袭。

lncRNAs与miRNA相互作用，发挥miRNA海绵或抑制剂的作用，并调节对miRNA靶点的抑制。越来越多的报道表明，UCA1是一种致癌的lncRNA，它与肿瘤抑制miRNA如miR-507、miR-145、miR-16和miR-216b相互作用并抑制miRNA表达。基于miRanda和荧光素酶报告基因检测，可确定肿瘤抑制miR-143基因在UCA1中的结合位点的3＇UTR。此外，研究结果显示，UCA1过表达在A431细胞中明显抑制miR-143的表达，下调UCA1明显上调了miR-143的表达。miR-143已被发现在多种癌症中抑制EMT和细胞侵袭，从而起抑癌作用包括脊髓胶质母细胞瘤、胃癌、膀胱癌和乳腺癌［16-17］。本研究结果表明，miR-143在CSCC组织和细胞中表达下调，下调miR-143明显促进A431细胞的增殖、侵袭和EMT，UCA1可能作为与miR-143竞争的内源性RNA，抑制miR-143表达，从而促进CSCC A431细胞的增殖、侵袭和EMT。提示miR-143作为肿瘤抑制基因和EMT的负调控因子发挥作用。因此，UCA1可能通过吸附上皮间质转化酶相关miRNA而发挥癌基因的作用。有研究表明HK2在各种癌症如胃癌、结直肠癌中发挥关键作用［18-19］，而本研究结果表明HK2在A431细胞中表达下调，siRNA干扰HK2表达后明显抑制了A431细胞的增殖、侵袭和EMT。

综上所述，本研究证明了lncRNA UCA1通过激活miR-143/HK21通路促进CSCC的增殖、侵袭和EMT，这可能在CSCC A431细胞的病理中发挥重要的调节作用。