梅毒疫苗研究进展

柯吴坚，郑刚，塔依尔·吐尔洪，陈永恒，杨斌

1.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091；2.喀什地区第一人民医院，新疆 喀什 844000

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，Tp)感染引起的一种可危害全身各组织器官的性传播疾病［1］。尽管青霉素治疗梅毒便宜有效，但最新的流行病学数据显示，全球约1 800万人感染梅毒，每年新发梅毒感染者高达560万例，因此防控梅毒迫在眉睫［2］。除了采用被动药物治疗，能否找到一种有效的预防梅毒感染方法是近年来梅毒研究热点。但由于Tp外膜蛋白的不稳定性、Tp体外培养困难、无法进行基因遗传编辑等缺点［1］增加了Tp疫苗研究难度。因此与其他病原体疫苗的开发相比，Tp疫苗研究进展缓慢，目前仅有少数梅毒研究学者对梅毒疫苗候选基因进行筛选和鉴定。本文将从以下几方面综述近年来梅毒疫苗研究进展。

1 早期研究证实梅毒疫苗的可行性

早在上世纪六十年代末期，Metzger等［3］首次采用4℃短期储存制备减毒Tp，并将处理后的Tp对兔行静脉内和肌内免疫接种，结果显示该方法可部分保护兔免受Tp感染。研究显示，严酷化学或热灭活Tp可能破坏Tp脆弱的外膜蛋白，从而无法诱导兔产生免疫保护力。该研究为Tp保护性抗原的不稳定性提供了强有力的证据。通过兔静脉内注射老龄Tp进行免疫接种，免疫后在兔背部再次接种具有传染性的Tp，兔并没有形成硬下疳皮损或检测出Tp；接种老龄Tp兔的淋巴结进行兔淋巴结转移实验，结果显示16只兔中，有6只表现出完全免疫保护力［3］。老龄Tp传染性低且保留了Tp完整外膜蛋白的特点，因此诱导宿主可产生部分甚至是完全的免疫保护作用，提示低传染性且含有完整的Tp外膜蛋白在疫苗研究的重要性。该研究进一步证实：①肌内注射老龄Tp也能提供部分保护作用，但不如静脉内注射有效；②灭活Tp菌量的不同，对诱导兔形成Tp免疫保护作用存在明显差异，其中1.2×1010Tp菌量免疫接种兔的免疫保护力优于3×109～6×109Tp菌量。以上研究表明静脉免疫和高菌量在Tp诱导宿主产生免疫保护中起着重要作用。由于临床患者感染Tp量远低于1.2×1010Tp菌量，因此该研究结果也进一步解释了为何临床患者感染Tp后无法产生足够的免疫保护力。在上世纪七十年代早期，Miller等［4］完成另一个梅毒疫苗开发领域的标志性研究，他们通过采用γ射线照射Tp，使其成为无感染性Tp。该方法既保留了完整、易变、脆弱的Tp表面抗原含量，又保留了Tp的运动性，使得Tp免疫兔处于非感染和非增殖性，从而不能建立感染。经过以上方法处理后的总量为3.71×109的Tp菌株量免疫兔后，再以同源的Tp感染，结果显示：①在感染注射部位没有出现硬下疳皮损；②淋巴结转移实验阴性；③在免疫后期至少一年内仍具有完全保护力；④该保护性对其他Tp株(Haiti B)感染无保护作用。实验证实该方法可诱导兔形成对相同Tp菌株感染具有完全保护作用，进一步表明梅毒疫苗研究的可行性。综合早期Tp疫苗研究得出以下结论：①具有诱导形成免疫保护作用的Tp抗原是热不稳定且脆弱的，因此保护性免疫的形成取决于Tp完整的、未破坏的表面抗原的存在；②高剂量灭活的Tp及长久的免疫计划(37周)表明Tp外膜蛋白缺乏，需高剂量、重复多次Tp接种才能缓慢形成保护性免疫性；③Tp免疫不能赋予宿主产生对异源性Tp菌株的交叉免疫保护力，表明保护性抗原在病原体之间存在差异性；④在兔模型中证实免疫保护时间持久(长达至少1年)，表明Tp疫苗的可行性。

2 单个Tp抗原作为梅毒疫苗的探索

随着上世纪九十年代末期Tp基因组测序的完成，选用单个Tp抗原作为Tp疫苗成为可行。已经用于验证Tp免疫保护力的Tp抗原包括Tp92［5-6］、TprK［7-9］、TprI［10］、TprF［11］、Gpd［12］、TmpB［13］、TpN15［14］、TpN47［15］、Tp0155［15］、Tp0483［15］、Tp0956［15］和4D［16］。用Tp92、4D、Gpd和TprF抗原免疫兔表现出硬下疳皮损形成减缓，表明这些抗原具有部分免疫保护作用，但后续的兔感染实验证实其缺乏完全免疫保护能力。此外，具有抗原变异的TprK蛋白免疫兔可诱导引起宿主形成抗Tp感染的部分保护作用，分子水平研究显示保护部分定位于TprK蛋白的N-末端［7-9］。然而不同的研究团队在研究相同Tp抗原(TprK［17］、Gpd［18］和Tp92［6］)诱导兔形成免疫保护能力的结果存在差异。根据梅毒感染兔模型的研究表明，梅毒Tpr蛋白家族成员免疫后的兔在对抗Tp攻击时，硬下疳皮损形成减弱［9，11］。通过蛋白水平和分子水平预测发现该蛋白家族特定成员位于Tp外膜表面［19-20］，其蛋白环型区域表现出广泛的序列突变［21］，可引起抗原变异［22］和相变异［23］，表明该蛋白家族特定成员的序列突变在Tp持续感染和易感个体的Tp再感染中发挥重要作用。以上研究表明Tp抗原间存在变异将是梅毒疫苗开发的难点。

3 黏附素抗原对抗梅毒感染中的作用

Tp具有黏附宿主纤连蛋白、层黏连蛋白、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅳ的能力早在上世纪八十年代中期得到证实，表明宿主细胞外基质成分是Tp黏附的主要目标［24］。直到上世纪九十年代末期，Tp全基因组序列的阐明［25］为参与黏附到细胞外基质成分的Tp黏附素的确认铺平了分子生物学道路，从而识别出4个具有黏附宿主成分的Tp黏附素(Tp0136［26-27］、Tp0155［28］、Tp0483［28-29］和Tp0751［30-34］)。在Tp早期感染过程中，当高度侵袭性的Tp遇到宿主体内各种组织成分时，这种多重黏附能力将使其发挥出广泛黏附宿主的作用。Tp0136最初注释为未知功能的假定蛋白［25］，随后通过多项研究［26-27，35-37］进一步证实：①Tp0136具有黏附细胞纤连蛋白的能力，且黏附细胞纤连蛋白能力强于血浆纤连蛋白；②Tp0136保守的NH2端是主要黏附作用区；③Tp0136抗体可以抑制Tp黏附到宿主血浆和细胞纤连蛋白；④Tp0136与宿主不同组织细胞系的黏附能力存在差异；⑤Tp0136通过C-C基序配体2(C-C motif ligand 2，CCL2)/C-C基序配体2受体(CCL2 receptor，CCR2)信号通路对纤连蛋白RGD结构域与整合素β1的相互作用促进人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial，HMEC-1)迁移；⑥Tp0136通 过TLR4、ERK、JNK、PI3K和NF-κB信号通路诱导单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)/CCR2表达促进成纤维细胞迁移，从而促进梅毒硬下疳皮损自愈；⑦高滴度Tp0136抗体可促进炎症细胞向局部皮损浸润，加重组织损伤，延缓创面愈合，对梅毒感染缺乏保护作用。Tp0155和Tp0483同样是具有黏附宿主纤连蛋白能力的Tp黏附素［28-29］，前者可黏附到细胞纤连蛋白，而后者具有黏附血浆或细胞纤连蛋白的能力。通过功能化自组装单分子膜(functionalized self-assembled monolayers，SAMs)证实Tp0483的274-289和316-333氨基酸序列为主要黏附纤连蛋白作用区［29］。通过将Tp0155和Tp0483重组蛋白分别接种新西兰白兔，尽管可获得高滴度(＞1∶50 000)血清抗体，但该抗体缺乏对梅毒感染保护［6］。大量体外研究［30-34］显示Tp还可通过Tp0751蛋白黏附到广泛分布在宿主体内的多种层黏连蛋白(包括层黏连蛋白1、2、4、8和10亚型)。使用穿梭载体pKMR4PEMCS将Tp0751转染到无黏附、可体外培养的溃蚀齿密螺旋体上，可赋予异源表达Tp0751的溃蚀齿密螺旋体具有黏附层黏连蛋白的能力；而重组Tp0751抗体可特异性抑制异源表达Tp0751蛋白溃蚀齿密螺旋体黏附层黏连蛋白［31］。Tp0751除了黏附层黏连蛋白还可经自催化裂解作用降解层黏连蛋白和纤维蛋白原［30，33-34］。采用全长Tp0751免疫新西兰白兔，评估Tp0751对局部或播散性Tp感染是否具有保护作用，两个不同的研究团队却得出完全相反的实验数据。Luthra等［38］研究提示Tp0751不能激发调理抗体或保护性抗体；而Lithgow等［39］研究显示Tp0751免疫的新西兰白兔可对抗Tp感染，是一种有前途的梅毒疫苗候选蛋白。不同实验室间结果差异性的存在，提示梅毒疫苗开发和建立需要一套完善的Tp实验室标准化操作和验证流程。

4 结语

世界范围内梅毒的广泛持续流行、特定地区和男男性行为者梅毒感染率的不断增加，证明单纯依靠公共卫生举措无法有效阻止梅毒蔓延。由于目前对Tp发病机理了解非常有限，与Tp研究相关技术复杂，使得梅毒疫苗开发进展缓慢。虽然梅毒疫苗研发存在诸多难点，需要一一克服，但相信经过政府干预和梅毒研究学者积极参与，通过发现有希望的新疫苗候选物、优化免疫佐剂、增强免疫保护性等方法，在不远的将来可开发出明显降低Tp感染性的梅毒疫苗，从而减少全球梅毒的发病率。