七氟烷对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌的保护作用及其机制

白雪 宋思宜 郭海燕 赵洋 王士雷 李瑜

(青岛大学附属医院麻醉科，山东 青岛 266003)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是临床常见的病理过程，是冠心病发病以及心肌血运重建治疗过程中心肌损伤的核心环节，如何减轻缺血再灌注损伤一直是国际研究的热点之一。七氟烷是目前临床应用最为广泛的吸入性麻醉药。研究发现，围手术期吸入七氟烷对心肌有保护作用[1-2]。随着研究的深入，SARKAR等[3]证实七氟烷后处理(SPC)可调节围手术期患者心血管系统的功能，如增加心肌收缩力、减轻MIRI所致心肌梗死等。在糖尿病大鼠受损的心肌组织中，SPC可显著上调HIF1α及其下游递质血管内皮生长因子蛋白的表达,减少心肌梗死面积，改善心脏功能[4]。研究表明，HIF2α可以诱导双调蛋白(AREG)的表达[5]，该研究首次提出心肌细胞特异性HIF2α能增加心肌缺血耐受性，并且AREG可抑制HIF2α缺失小鼠的MIRI。但七氟烷对心肌细胞的保护作用是否与HIF2α-AREG通路有关，目前尚不明确。本研究通过构建大鼠MIRI模型，检测经不同方式处理的大鼠血流动力学、心肌梗死面积的变化，以及大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2表达的变化，探讨七氟烷对心肌细胞的保护作用及其与HIF2α-AREG通路的相关性。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 成年清洁级雄性SD大鼠45只，体质量280～320 g，由山东省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(鲁)20140007。实验前大鼠于安静环境下，24 ℃恒温饲养3～4 d，正常饮食，12-12 h明暗交替光照。所有大鼠实验前12 h禁食不禁水。

1.1.2主要试剂及实验设备 AREG蛋白购自加拿大Biomatik公司，PT2385购自美国MCE公司，兔抗大鼠Bax、Bcl-2抗体购自武汉三鹰公司，正置白光显微镜(日本Olympus公司)，HX-100E小动物呼吸机购自成都泰盟科技有限公司。蛋白电泳系统购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组及处理 根据处理方法不同将大鼠随机分为A、B、C、D、E组，每组9只大鼠。

A组在MIRI模型制备过程中[6]，分离出左冠状动脉前降支(LAD)后，在LAD下方穿线但不结扎，观察160 min；B组在建立大鼠MIRI模型后，结扎LAD 40 min，随后松开结扎线再灌注120 min；C组在B组操作的基础上，再灌注开始时大鼠先吸入体积分数0.024的七氟烷15 min，然后停止吸入七氟烷继续再灌注105 min；D组于MIRI模型制备前1 h先腹腔注射HIF2α阻滞剂10 mg/kg，其后操作同C组；E组大鼠于LAD结扎前15 min经颈内静脉注射AREG蛋白50 μg，其余操作同D组。处理过程中每组随机选取5只大鼠，分别检测缺血前、缺血15 min及再灌注2 h末的心率和血压。

1.2.2标本处理及各项指标的检测 ①上述各组大鼠处理结束后，每组随机选取3只大鼠切取的心尖组织，HE染色后，显微镜下观察心肌细胞的形态；②每组再随机选取3只大鼠，均再次结扎LAD后，在颈内静脉注射伊文斯蓝溶液3 mL，当大鼠眼睛内出现伊文斯蓝时，快速取下心脏，保留左心室部分，生理盐水冲洗后，于-80 ℃冰箱冷冻后切薄片，TTC染液脱色，置于37 ℃水浴箱中15 min，然后用组织固定液固定过夜，分离左心室和梗死部分(白色部分)并分别称质量,比较各组大鼠心肌梗死质量占左心室质量的比值；③每组取剩余3只大鼠，快速取下心脏，切取包含心尖的1/3体积心脏，去掉右心室，保留左心室部分，称质量。用组织裂解液裂解组织，获取组织液，离心后取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。以40 μg蛋白量计算每组的上样体积,加入上样缓冲液,煮沸变性，并按照Western Blot试剂盒说明书进行操作；封闭结束后，分别加入兔抗大鼠单克隆抗体Bax(稀释比1∶5 000)、Bcl-2(稀释比1∶4 000)4 ℃孵育过夜；次日洗膜以后加入二抗，室温孵育以后加入显影液，采用凝胶成像仪观察。用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白的条带灰度值表示目的蛋白的表达水平，计算各组大鼠的Bax/Bcl-2比值。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠心率及平均动脉压变化

时间、分组、时间与分组交互作用对大鼠心率无明显影响(P>0.05)，对大鼠平均动脉压有明显影响(F时间=101.41，F组间=10.23，F交互=6.93，P<0.05)。各组缺血前心率及平均动脉压比较差异无显著性(P>0.05)。除A组外，其余各组大鼠不同时间点平均动脉压比较差异有显著性(F=16.07～34.08，P<0.05)，其中各组大鼠缺血15 min和再灌注2 h末与缺血前平均动脉压相比均具有明显下降(P<0.05)，C组和E组再灌注2 h末平均动脉压较缺血15 min时明显上升(P<0.05)。再灌注2 h末，与B组相比，C、E组平均动脉压均有明显上升(F=13.62，P<0.05)，而D组与B组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠缺血前、缺血15 min及再灌注2 h末心率及平均动脉压比较

2.2 各组大鼠心肌梗死质量占左心室质量比值

B～E组大鼠的心肌梗死质量占左心室质量比值为0.207±0.003、0.115±0.009、0.207±0.010、0.112±0.008，组间比较差异有显著性(F=193.26，P<0.05)，其中C、D组与B组及D组与E组大鼠心梗质量占左心室质量比值比较差异有显著性(t=14.24～20.01，P<0.05)。

2.3 各组大鼠心肌组织Bax/Bcl-2比值比较

A～E组大鼠心肌组织Bax/Bcl-2比值分别为2.56±0.11、20.92±4.37、5.30±0.29、11.34±1.22、3.54±0.34，各组间比较差异均具有显著意义(F=27.92，P<0.05)，A、C组与B组以及C、E组与D组大鼠心肌组织Bax/Bcl-2比值比较差异有显著意义(t=5.04～6.79，P<0.05)。

2.4 各组大鼠光镜下心肌细胞形态比较

光镜下观察，A组大鼠心肌细胞排列整齐，无水肿(图1A)；B组大鼠心肌细胞严重水肿，心肌细胞周围可见炎性细胞聚集，心肌纤维组织周围红细胞渗漏(图1B)；C组大鼠心肌细胞轻度水肿，心肌细胞周围可见少量炎性细胞聚集，心肌细胞排列比较整齐(图1C)；D组大鼠心肌细胞水肿、核固缩严重，心肌细胞周围可见大量炎性细胞积聚(图1D)；E组大鼠心肌细胞水肿程度较轻，心肌细胞排列略为紊乱，心肌细胞周围炎性细胞聚集不明显(图1E)。

A～E分别为A～E组，HE染色法，400倍图1 光镜下各组大鼠心肌组织HE染色结果

3 讨 论

心肌缺血治疗的关键是尽快恢复缺血区域的血供，但是再灌注又会产生MIRI。迄今为止，溶栓疗法仍然是目前治疗急性心肌缺血的有效方法[7]。在心肌缺血期间，心肌组织氧供减少，缺氧严重[8]，而低氧诱导因子(HIFs)是低氧适应性转录反应的主要调节因子[9]，在心脏适应性反应中发挥着作用，降低心肌梗死的程度[6]，抑制HIFs的降解，从而减轻MIRI[10-11]。远程缺血预处理对疑似首次心肌梗死的患者具有心肌保护作用[12]，而这一保护作用在敲除了HIF1α基因的小鼠中消失，证明HIF1α在远程缺血预处理诱导的心脏保护中起着重要作用[13]。

HIF2α是一种由缺氧敏感的HIF2α亚单位与其专一性伴侣亚单位ARNT二聚体形成的异二聚体转录因子[14]。研究显示，HIF2α是肝癌治疗的首选靶点[15]，且HIF2α阻滞剂对肾细胞癌早期模型有效[16]。但HIF2α对心肌细胞的影响研究报道较少，并且其与七氟烷在心肌细胞保护作用中的相关性也不是很清楚。KOEPPEN等[5]研究发现，激活HIF2α-AREG通路可抑制小鼠MIRI，改善缺血后数周小鼠的心脏功能，同时在缺血性心肌病患者中AREG表达增强。这些发现表明重组AREG可用于预防性治疗心脏手术患者，以增强心肌缺血耐受。因此本研究拟通过建立大鼠MIRI模型来探讨七氟烷对心肌缺血的保护作用是否与HIF2α-AREG通路有关，明确七氟烷对心肌保护作用的具体机制。

SPC可以发挥类似于缺血预处理或缺血后处理的心肌保护作用，这是应对围手术期MIRI损伤的一种非常有效的手段[17-18]。本研究发现C组缺血15 min和再灌注2 h末平均动脉压均高于B组，且C组心梗质量占左心室质量比值小于B组，表明C组心肌损伤轻于B组，也证实了七氟烷对心肌细胞具有保护作用。而在同样使用了七氟烷的情况下，加入了HIF2α阻滞剂的D组心梗质量占左心室质量比值大于C组且Bax/Bcl-2比值上调，但是与B组相比差异无显著性。Bax/Bcl-2比值上调表明细胞趋于凋亡状态[19]，表明经HIF2α阻滞剂预处理的心肌MIRI的大鼠，即使应用了对心肌组织具有保护作用的七氟烷，心肌梗死仍然加重。由此推断临床上使用了HIF2α阻滞剂治疗其他疾病的心肌缺血患者，七氟烷对患者的心肌组织可能不能发挥保护作用。与D组相比较，E组心梗质量占左心室质量比值显著减小，光镜下心肌细胞的结构更完整且Bax/Bcl-2比值下调，表明E组心肌细胞损伤轻于D组。由此猜测对于正在使用HIF2α阻滞剂治疗其他疾病且伴有心肌缺血的患者，虽然七氟烷的心肌保护作用被抵消，但仍然可以考虑应用重组AREG蛋白来减轻MIRI。

综上所述，SPC能够减轻大鼠MIRI，减轻心肌梗死面积，改善血流动力学；HIF2α抑制剂可以抵消七氟烷的心肌保护作用，使心肌损伤加剧。而重组AREG则可以改善心功能、增强对血流动力学的保护。但是本研究有一定的局限性，首先，本研究使用的是特定药物阻滞剂而不是基因操作来阻断HIF2α；第二，本研究仅采用动物实验证明了SPC对心肌具有保护作用且该保护作用可以通过HIF2α-AREG通路来实现，没有进行临床研究。因此，有必要进一步的临床试验研究进行验证。