山药多糖对2型糖尿病大鼠肾损伤的保护作用及Wnt/β-catenin信号通路的影响

孔茹欣，王子婧，孙悦，张启慧，韩妤霖，齐悦

（1.牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院公共卫生学院公共卫生实验中心，黑龙江 牡丹江 157011）

0 引言

目前，2型糖尿病肾病发病机制尚未完全明确，现有临床相关研究指出，炎性细胞浸润、组织缺氧、遗传因素、糖代谢紊乱、脂代谢紊乱以及血液动力学因素等均可以引起糖尿病肾病[1]。在美国和大多数发达国家，糖尿病肾病和糖尿病肾病是导致终末期肾病的主要原因。在美国，糖尿病占终末期肾病发病率的30%～50%[2]。目前，糖尿病肾病已经成为一个重大的公共卫生问题，30%～40%的糖尿病患者发展为糖尿病肾病。糖尿病肾病患者的特殊治疗可分为4个主要领域：心血管风险降低、血糖控制、血压控制和肾素-血管紧张素系统（RAS）抑制[3-4]。有研究指出，通过多因素干预能够延缓2型糖尿病患者糖尿病肾病进程，但是无法完全预防终末期肾病的发生[5]。不过但是由于2型糖尿病肾损伤发病人群日益增多，因而积极探寻有效治疗药物具有重要临床价值。Wnt信号通路是最重要的信号通路之一，Wnt/β-catenin信号通路异常活化与糖尿病肾病发生及发展密切相关[6]。山药多糖是山药中的主要活性成分，具有抗突变、抗衰老、降血糖血脂以及提高免疫力等作用。本研究分析了山药多糖对2型糖尿病大鼠肾损伤的保护作用及Wnt/β-catenin信号通路的影响，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料。SPF级雄性SD大鼠32只，周龄为8周，体重为（200±20）g；购自安徽医科大学实验动物中心（SCXK【皖】2015-0001）。山药多糖为自制，纯度为95%；链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；雷公藤多苷购自[远大医药（中国）有限公司]；HE染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，反转录试剂盒及实时定量PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；强生-稳豪倍优型血糖仪购自美国强生公司，日立7600型全自动生化仪购自日本日立株式会社。

1.2 方法

1.2.1 建立模型：所有大鼠均适应性喂养1周，随机分为空白对照组（n=8）和糖尿病模型组（n=24）。糖尿病模型组给予高糖高脂饲料，空白对照组给予颗粒型普通饲料喂养。喂养4周后，禁食12 h，糖尿病模型组大鼠单次腹腔注射60 mg/kg的STZ，建立2型糖尿病肾损伤大鼠模型，对照组同时给予注射等量枸橼酸钠溶剂。建模3d后测量血糖水平，如果在16.7 mmoL/L以上则建模成功。

1.2.2 分组及用药：糖尿病模型组随机分为糖尿病肾病组、山药多糖组和雷公藤多苷组，每组8只。雷公藤多苷组大鼠给予8 mg·kg-1·d-1灌胃治疗；山药多糖组大鼠给予100 mg·kg-1·d-1灌胃治疗；糖尿病肾病组大鼠未给予药物干预。共干预8周时间。

1.2.3 标本处理：干预8周后于麻醉状态下处死大鼠，处死之前收集大鼠24 h尿液；经心脏留取大鼠血液标本；剖腹采集大鼠双肾，统一收取左肾，其中一半放置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，时间为24 h；剩余一半放置于-80℃冰箱中保存待用。

1.2.4 肾脏组织HE染色：将置于4%多聚甲醛溶液中进行固定的大鼠肾脏组织切为4μm厚度的薄片，放入一次性蜡盒当中，取蒸馏水进行冲洗，逐次进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明以及浸蜡，石蜡包埋，常规性HE染色，于光镜下观察大鼠肾脏组织变化情况。

1.2.5 Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量：通过RT-PCR法检测各组大鼠肾组织中Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量，取-80℃冰箱中保存待用的肾脏组织，以Trizol法提取细胞的总RNA，然后反转录合成为cDNA，所需引物由上海英骏生物技术有限公司设计合成，引物序列见表1；扩增反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性15 s，退火60℃30s，72℃延伸30 s，共35次循环，最后72℃延伸5 min。GAPDH作为内参，全自动图像分析系统分析电泳图，采用2-△△Ct表示相对表达量。

表1 Wnt-1、β-catenin引物

1.2.6 血糖及肾功能指标：通过强生-稳豪倍优型血糖仪检测大鼠空腹血糖水平，通过日立7600型全自动生化仪检各组大鼠的血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量水平。

1.3 统计学处理。通过SPSS 20.0进行统计学分析，计量资料采用均值±标准差（±s）表示，多组计量资料采用方差分析。P＜0.05表示存在显著差异。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏病理变化情况观察。空白对照组大鼠肾小管上皮细胞排列整齐，肾小球与肾小管形态正常，HE染色结果显示大鼠肾脏无明显病理改变；糖尿病肾病组大鼠肾间质出现明显纤维化，肾小管管腔增大，小管间质内存在炎性细胞浸润以及基质增多；经过8周治疗后，雷公藤多苷组和山药多糖组大鼠肾脏病理改变明显减轻。

2.2 各组大鼠空腹血糖水平及肾功能指标比较。糖尿病肾病组、雷公藤多苷组、山药多糖组空腹血糖、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均明显高于空白对照组，且雷公藤多苷组、山药多糖组明显低于糖尿病肾病组（P＜0.05）；雷公藤多苷组和山药多糖组空腹血糖水平及肾功能指标比较无明显差异（P＞0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠空腹血糖水平及肾功能指标比较（±s）

表2 各组大鼠空腹血糖水平及肾功能指标比较（±s）

注：与空白对照组比较,aP＜0.05；与糖尿病肾病组比较,bP＜0.05。

组别 空腹血糖(mmol/L)尿素氮(mmol/L)血肌酐(μmol/L)24h尿蛋白定量(mg)空白对照组 5.68±0.91 53.76±9.17 6.83±0.59 10.97±2.91糖尿病肾病组 20.09±3.25a 142.36±16.89a 24.23±1.24a 46.38±4.79a雷公藤多苷组 12.26±2.87ab 89.11±13.46ab 11.07±0.78ab 21.82±3.26ab山药多糖组 10.32±2.18ab 81.25±12.57ab 10.15±0.74ab 20.14±3.08ab

2.3 各组大鼠Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量比较。糖尿病肾病组、雷公藤多苷组、山药多糖组Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量均明显高于空白对照组，且雷公藤多苷组、山药多糖组明显低于糖尿病肾病组（P＜0.05）；雷公藤多苷组和山药多糖组Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量比较无明显差异（P＞0.05）。详见表3。

表3 各组大鼠Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量比较（±s）

注：与空白对照组比较,aP＜0.05；与糖尿病肾病组比较,bP＜0.05。

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3 讨论

临床上，2型糖尿病肾病是2型糖尿病患者极为常见的一种并发症，严重威胁人们身心健康。糖尿病肾病的典型表现为早期的高滤过和蛋白尿，随后是进行性肾功能下降。糖尿病肾病的表现可能有所不同，尤其是在2型糖尿病患者中，同时存在其他肾小球/肾小管病变和严重的外周血管疾病可能成为重要的混杂因素。糖尿病肾病患者的全因死亡率约为无肾病的糖尿病患者的30倍，绝大多数糖尿病肾病患者在到达终末期肾病之前会死于心血管疾病。

山药多糖是山药主要活性成分，随着临床相关研究逐步深入发现，山药多糖具有良好的降血脂、降血糖等作用，可通过促进胰岛素分泌、清除自由基以及改善胰岛β细胞功能等，降低糖尿病大鼠血糖水平[7]。本研究结果显示，糖尿病肾病组大鼠肾间质出现明显纤维化，肾小管管腔增大，小管间质内存在炎性细胞浸润以及基质增多，说明糖尿病肾病组大鼠存在明显肾脏损害；经过山药多糖干预后，肾损害明显减轻。同时，本研究发现，糖尿病肾病组、雷公藤多苷组、山药多糖组空腹血糖、血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量均明显高于空白对照组，且雷公藤多苷组、山药多糖组明显低于糖尿病肾病组（P＜0.05），说明山药多糖能够减轻糖尿病大鼠肾组织损伤，降低血糖水平及改善肾功能。

目前，糖尿病肾病发生机制并未完全清楚，研究显示，高糖引起的Wnt/β-catenin信号通路异常活化与糖尿病肾病的发生及发展存在密切关系[8]。Wnt信号的复杂性及其功能作用对发育和生长至关重要，它在胚胎发生过程中最活跃，通过细胞分化、极化和迁移促进新生物体的形成，它的激活在许多肿瘤和其他疾病的发展过程中也很常见。纤维化是病理性重塑的最终标志，它是各种慢性疾病和衰老相关器官衰竭的主要发病机制，以完全控制慢性伤口愈合和恢复组织功能。纤维化的过程涉及肾、肺、肝、心脏和其他组织疾病的发病机制[9]。Wnt在异常的伤口修复和纤维形成中是一个高度保守的信号，持续的Wnt激活与纤维化的发病机制相关，特别是越来越多的证据表明Wnt信号在细胞命运决定、增殖和细胞极性建立中起着重要作用[10]。Wnt信号在不同组织中的表达和分布随着年龄的增长而变化，这些变化对维持组织内环境平衡具有关键作用。Wnt信号通路异常活化可以造成肾脏固有细胞如肾小球系膜细胞以及足细胞等的增殖、凋亡，进而引起肾脏疾病[11]。越来越多的研究表明，许多Wnt抑制剂具有抗组织纤维化的潜在作用，特别是在肾纤维化和Wnt信号在衰老相关疾病中的作用[12]。Wnt/β-catenin信号通路可以提高Ⅳ型胶原的表达，引起肾小管间质纤维化。因此，抑制Wnt/β-catenin信号通路异常活化对于改善糖尿病肾病具有重要意义。本研究中，糖尿病肾病组、雷公藤多苷组、山药多糖组Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量均明显高于空白对照组，且雷公藤多苷组、山药多糖组明显低于糖尿病肾病组（P＜0.05），而雷公藤多苷组和山药多糖组Wnt-1、β-catenin的mRNA相对表达量比较无明显差异（P＞0.05），说明山药多糖能够降低糖尿病大鼠肾脏组织中Wnt-1、β-catenin表达水平，进而发挥肾脏保护的作用。

综上所述，山药多糖对2型糖尿病大鼠肾损伤有一定保护作用，可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路异常激活有关。