呼吸道病原菌基因检测法在诊断儿童肺炎链球菌感染中的应用价值分析

陶建萍，蔡永林

（梧州市红十字会医院医学检验科一区，广西 梧州 543002）

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是一种革兰阳性菌，直径约为1 μm，菌体似矛头状，成双或成短链状排列。肺炎链球菌感染主要引起人类大叶性肺炎。该病原菌属于苛养型细菌，对其进行培养的条件相对较高[1]。目前，临床上主要是采用细菌培养法及聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术、免疫荧光技术等对肺炎链球菌进行病原学检测，但通常只能检测一类抗原，对于混合感染或其他抗原则无法检出。因此，寻找一种高效、敏感、特异、快速的肺炎链球菌病原学检测技术至关重要[2-3]。本文主要是探讨呼吸道病原菌基因检测法在诊断儿童肺炎链球菌感染中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2018 年2 月至2019 年2 月期间收治的300例初步诊断为细菌性肺炎的患儿作为研究对象。其纳入标准是[4]：存在高热、寒战、咳嗽、咳痰等症状；白细胞计数和血清C 反应蛋白的水平升高；病历资料完整；其家长知悉本研究内容，并签署了自愿参与本研究的知情同意书。其排除标准是：合并有呼吸道感染以外的其他感染；病历资料缺失；中途转院或退出本研究。在这些患儿中，有男165 例，女135 例；其年龄为5 个月～13 岁，平均年龄为（4.11±1.43）岁；其病程为2 ～9 d，平均病程为（5.35±1.79）d；其中，采集支气管肺泡灌洗液作为检测标本的患儿有91 例，采集深部痰作为检测标本的患儿有209例。本研究已通过我院医学伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集、处理 深部痰标本：为患儿采集深部痰标本的时间为入院后接受抗菌治疗前，并由专业护士进行采集。在采集标本当天的清晨，为患儿清洁口腔，采用吸痰器获取其2 份呼吸道深部痰液，置于无菌试管中保存待检。每低倍镜视野内的白细胞数超过25 个且上皮细胞数小于10 个为达到深部痰的采集要求。支气管肺泡灌洗液：将Olumpus/Fujinon 纤维支气管镜经患儿的鼻腔插入支气管内，到达感染肺段后经配套的洗涤管镜快速注入温生理盐水10 ～20 mL，对灌洗液进行负压吸引，将吸引出的灌洗液收集在无菌瓶内备检，灌洗液应收集超过5 mL。收集后的深部痰标本和支气管肺泡灌洗液需在30 min 内送测。

1.2.2 传统的病原菌培养 将支气管肺泡灌洗液或深部痰标本接种于哥伦比亚平板上（平板内含有5% 的绵羊血），将平板放入含二氧化碳（浓度5% ～10%）的恒温培养箱中培养24 ～48 h。对标本进行染色镜检，分离病原菌，并采用胆汁溶菌试验和Optochin 试验鉴定分离出的病原菌是否为肺炎链球菌。

1.2.3 呼吸道病原菌基因检测 1）试剂与仪器。呼吸道病原菌核酸提取试剂、细菌基因组DNA 提取试剂盒Ⅱ、20μL的恒温扩增试剂（作为反应液）、RtisochipTM–A 恒温扩增微流控芯片核酸分析仪及配套的软件。2）检测方法。采用呼吸道病原菌核酸提取试剂及恒温扩增芯片法提取支气管肺泡灌洗液或深部痰标本中的核酸，立即对核酸进行基因检测。检测完成后，采用最大二阶倒数法计算出“S”型扩增曲线进入快速扩增期的第一个拐点，“S”型曲线的首个拐点与原点对应时刻的差值≤30，表示检测结果呈阳性。核酸检测试剂盒能够检测出铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、耐甲氧西林葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌8 种常见的呼吸道病原菌。

1.3 观察指标

比较对这300 例患儿进行传统的病原菌培养及呼吸道病原菌基因检测的结果。比较进行传统的病原菌培养及呼吸道病原菌基因检测的用时。观察并记录对这300 例患儿的不同标本（支气管肺泡灌洗液标本和深部痰标本）进行呼吸道病原菌基因检测的结果及用呼吸道病原菌基因检测法诊断其肺炎链球菌感染的效能。统计进行传统的病原菌培养及呼吸道病原菌基因检测诊断儿童肺炎链球菌感染的一致性。

1.4 统计学方法

用SPSS 17.0 软件处理本研究中的数据，计数资料用%表示，用χ² 检验；符合正态分布的计量资料用±s表示，用t检验；不符合正态分布的计量资料用±s表示，用Mann-Whitney U 检验；采用Kappa 进行一致性检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 进行传统的病原菌培养及呼吸道病原菌基因检测的结果

对本研究中300 例患儿进行呼吸道病原菌基因检测的结果显示，其中肺炎链球菌呈阳性的患儿有165 例，呈阴性的患儿有135 例，其肺炎链球菌的阳性检出率为55.00%。对这300 例患儿进行传统的病原菌培养的结果显示，其中肺炎链球菌呈阳性的患儿有118 例，呈阴性的患儿有182 例，其肺炎链球菌的阳性检出率为39.33%。与对这300 例患儿进行传统的病原菌培养相比，对其进行呼吸道病原菌基因检测其肺炎链球菌的阳性检出率更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 进行传统的病原菌培养及呼吸道病原菌基因检测的结果

2.2 进行传统的病原菌培养与呼吸道病原菌基因检测的用时

对本研究中300 例患儿进行传统病原菌培养的平均用时为（46.31±6.17）h，对其进行呼吸道病原菌基因检测的平均用时为（1.95±0.29）h，二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 对不同标本进行呼吸道病原菌基因检测的结果

对本研究中300 例患儿的91 份支气管肺泡灌洗液标本进行呼吸道病原菌基因检测的结果显示，其中检测结果呈阳性的标本有49 份（其中有11 份标本为进行传统病原学培养结果呈阴性的标本）。对这300 例患儿的209 份深部痰标本进行呼吸道病原菌基因检测的结果显示，其中检测结果呈阳性的标本有116 份（其中有45 份标本为进行传统病原学培养结果呈阴性的标本）。详见表2。

表2 对不同标本进行呼吸道病原菌基因检测的结果（份）

2.4 用呼吸道病原菌基因检测法诊断患儿肺炎链球菌感染的效能

用呼吸道病原菌基因检测法诊断本研究中300 例患儿肺炎链球菌感染的特异度、灵敏度、总符合率、阴性预测值、阳性预测值分别为69.40%、92.37%、83.20%、93.38%、78.67%。当检测标本为支气管肺泡灌洗液时，用呼吸道病原菌基因检测法诊断这300 例患儿肺炎链球菌感染的特异度、灵敏度、总符合率、阴性预测值、阳性预测值分别为78.85%、95.00%、85.87%、95.35%、81.20%。当检测标本为深部痰时，用呼吸道病原菌基因检测法诊断这300 例患儿肺炎链球菌感染的特异度、灵敏度、总符合率、阴性预测值、阳性预测值分别为66.15%、91.03%、75.12%、92.47%、77.55%。详见表3。

2.5 进行传统的病原菌培养与呼吸道病原菌基因检测诊断儿童肺炎链球菌感染的一致性

本研究中，进行传统的病原菌培养与呼吸道病原菌基因检测诊断儿童肺炎链球菌感染的一致性较好（Kappa=0.625，P＜0.001）。详见表4。

表4 进行传统的病原菌培养与呼吸道病原菌基因检测诊断儿童肺炎链球菌感染的一致性（例）

3 讨论

儿童是社区获得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）的高发群体。调查发现，CAP 是导致5岁以下儿童死亡的主要原因，全世界每年有超过200 万婴幼儿死于CAP[5-6]。引起CAP 的病原体主要为细菌，其次为支原体、病毒、衣原体等。对细菌性肺炎患儿进行抗菌治疗前需明确其感染的病原菌种类，以便为其用抗菌活性强的抗生素，快速缓解其病情[7-8]。肺炎链球菌是引起小儿肺炎的主要病原菌之一。肺炎链球菌的病原学诊断较为困难，主要体现下在以下三个方面：1）进行病原菌培养时，需要通过侵入性操作采集患儿的支气管肺泡灌洗液、深部痰等标本进行检测，而获得患儿家长的同意较为困难。2）肺炎链球菌可产生自溶酶，因此对送检时间的要求较为严格。3）抗菌药物的广泛使用可对肺炎链球菌的培养结果产生影响[9-11]。近年来，随着分子生物学的兴起，临床上出现了新的病原学检测方法（即通过基因工程技术及生物学技术建立多种病原菌基因检测模型，用以检测各类病原菌），此方法具有灵敏、快速及全面等优点[12-13]。本研究中对患儿进行呼吸道病原菌基因检测使用的方法是恒温扩增芯片法。该方法在耶尔森菌、空肠弯曲菌、嗜肺军团菌等病原菌的病原学检测中也多有报道[14]。本研究的结果显示，用呼吸道病原菌基因检测法诊断本研究中300 例患儿肺炎链球菌感染的特异度、灵敏度、总符合率、阴性预测值、阳性预测值分别为69.40%、92.37%、83.20%、93.38%、78.67%；进行传统的病原菌培养与呼吸道病原菌基因检测诊断儿童肺炎链球菌感染的一致性较好。这与钱婧等[15]的报道基本一致。另外，对支气管肺泡灌洗液、深部痰等标本进行病原菌培养的时间较长，而对这些标本进行呼吸道病原菌基因检测的用时较短，在2 h 左右即可完成检测，具有操作简便、检测耗时短等优点。

综上所述，用呼吸道病原菌基因检测法诊断儿童肺炎链球菌感染的灵敏度、总符合率、阴性预测值等较高，与进行传统病原菌培养的结果一致性较好，且检测用时较短。