初探柚皮素对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺功能的保护作用

王 娟，肖亚军，刘荣雁，刘艳群

（绵阳市第三人民医院，四川 绵阳 621000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmoriary disease，COPD）是临床上常见的一种致死性疾病。有研究指出，预计到2030 年此病将成为全球第三大致死性疾病[1]。吸烟被认为是诱发COPD 的主要因素[2]。吸入香烟烟雾是慢性肺病发生发展的主要驱动因素，吸烟产生的气体混合物由约4500 种有害成分（包括尼古丁、一氧化碳、氰化物、甲醛、可吸入颗粒物等）组成[3]。肺脏长期接触这些有害物质会引发多种疾病，其中包括COPD 和肺癌[4]。柚皮苷主要存在于柑橘类水果中，是一种天然的二氢类黄酮，具有抗氧化、抗微生物、抗癌和抗炎等多种作用[5-6]。有研究发现，具有强大抗炎、抗氧化作用的柚皮素可用于治疗支气管损伤及炎症反应。相关的研究表明，柚皮素可通过激活Nrf2 通路治疗百草枯诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B病变[7]。在本文中，笔者主要是探讨柚皮素对COPD 大鼠模型肺功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD 大鼠，体重220±20 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2019-189。

1.2 实验试剂

柚皮素（Naringenin），购自西安汇林生物科技有限公司；脂多糖，购自索莱宝科技有限公司。

1.3 实验仪器

BW-YLS-8A 多功能诱咳引喘仪（上海软隆科技发展有限公司生产）；SAR-1000 多功能小动物呼吸功能测定仪（上海玉研科学仪器有限公司生产）；RM2016 转轮式切片机（德国徕卡公司生产）；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司生产）；DxH800 血液分析仪〔贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司生产〕。

1.4 实验方法

1.4.1 分组、造模及给药 取40 只SD 大鼠分为空白组、模型组、柚皮素低剂量组和柚皮素高剂量组，每组10 只大鼠。对除空白组大鼠外的其余各组大鼠均进行COPD 造模。具体的造模方法是：对大鼠进行为期1 周的适应性喂养后，开始对其进行造模。在进行造模的第1 d 和第14 d，为其在气管内滴注脂多糖，每次滴注1 mg/kg。分别于进行造模的第2 d ～第13 d、第15 d ～第28 d，对其进行香烟烟雾暴露处理。每日在同一时间将大鼠置于烟雾箱内进行2 次香烟烟雾暴露，每次点燃10 支香烟，每次暴露0.5 h。具体的暴露方法是：将点燃的香烟悬挂于烟雾箱内，然后将大鼠置入烟雾箱。从首次滴注脂多糖后第1 天开始，为柚皮素低剂量组大鼠使用低剂量的柚皮素进行灌胃（每次20 mg/kg，每天1 次），为柚皮素高剂量组大鼠使用高剂量的柚皮素进行灌胃（每次40 mg/kg，每天1 次），为空白组大鼠与模型组大鼠使用等量的生理盐水进行灌胃，各组大鼠均持续灌胃28 d。

1.4.2 检测呼吸功能指标 在末次给药24 h 后，使用4% 的戊巴比妥钠对各组大鼠进行麻醉，使用小动物呼吸功能测定仪检测其第一秒用力呼气量（forced expiratory volume in one second，FEV1）、呼吸峰值流量（peak expiratory flow，PEF）和用力肺活量（forced vital capacity, FVC）。

1.4.3 肺泡灌洗液细胞分类计数 末次给药24 h 后处死各组大鼠，收集其肺泡灌洗液，使用分析仪进行细胞分类计数，检测肺泡灌洗液中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与淋巴细胞的数量。

1.4.4 病理学观察 采集各组大鼠的肺脏样本，将其置于4%的多聚甲醇中固定24 h，然后进行脱水，并制作石蜡切片。使用苏木精- 伊红对切片进行染色后，在显微镜下观察其中肺脏组织的病理改变。

1.5 统计学分析

使用SPSS 25.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠呼吸功能指标的比较

对各组大鼠进行呼吸功能检测后发现，与空白组大鼠相比，模型组大鼠的FVC、FEV1、PEF 均较低，P＜0.05；与模型组大鼠相比，柚皮素高剂量组大鼠的FVC、FEV1、PEF 均较高，P＜0.05 ；柚皮素低剂量组大鼠与模型组大鼠的FVC、FEV1、PEF 相比，P＞0.05。详见表1。

表1 各组大鼠呼吸功能指标的比较（± s ）

表1 各组大鼠呼吸功能指标的比较（± s ）

注：*与空白组相比，P ＜0.05，#与模型组相比，P ＜0.05。

组别 FVC（L） FEV1（L） PEF（L/s）空白组（n=10） 6.853±0.462 77.85±3.72 47.51±1.30模型组（n=10） 6.013±0.111* 63.57±1.54* 35.90±4.56*柚皮素低剂量组（n=10）6.465±0.284 69.65±4.50 43.24±3.70柚皮素高剂量组（n=10）6.565±0.196# 70.43±3.68# 45.47±3.42#

2.2 各组大鼠的病理学检查结果

进行病理学检查的结果显示，空白组大鼠的肺脏组织结构较为正常，各级支气管结构完整清晰，肺泡形态较为正常，肺泡上皮细胞胞质染色均匀，胞核清晰，未见明显的变性坏死。模型组大鼠肺脏组织的基本形态结构被破坏，支气管结构较为模糊，支气管上皮细胞坏死，管腔内可见大量细胞团。其存在肺泡出血、破裂，肺泡上皮细胞弥漫性坏死后溶解，坏死区域大量粉染浆液渗出（内含细胞残片、炎症细胞和红细胞），支气管及血管周围存在明显水肿伴炎细胞浸润，其疏松结缔组织内可见大量淋巴细胞或中性粒细胞。柚皮素低剂量组大鼠部分区域肺泡结构被破坏，出现少量支气管上皮细胞坏死后脱落，肺泡上皮细胞小灶状坏死，坏死区域可见肺泡结构模糊，胞核裂解，胞质溶解，支气管及血管周围轻微水肿伴淋巴细胞浸润。柚皮素高剂量组大鼠的各级支气管较为正常，支气管上皮细胞排列较为整齐、紧密，存在少量肺泡上皮细胞变性坏死，坏死区域内可见巨噬细胞、中性粒细胞或淋巴细胞散在分布，其血管或支气管周围出现轻微水肿，结缔组织较松散。详见图1。

图1 各组大鼠的病理学检查结果

2.3 各组大鼠肺泡灌洗液细胞分类计数结果的比较

进行肺泡灌洗液细胞分类计数的结果显示，与空白组大鼠相比，模型组大鼠的肺泡灌洗液中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比均较高，P＜0.05；与模型组大鼠相比，柚皮素高剂量组大鼠的肺泡灌洗液中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比均较低，P＜0.05 ；柚皮素低剂量组大鼠与模型组大鼠的肺泡灌洗液中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比相比，P＞0.05。详见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液细胞分类计数结果的比较（%,± s ）

表2 各组大鼠肺泡灌洗液细胞分类计数结果的比较（%,± s ）

注：*与空白组相比，P ＜0.05，#与模型组相比，P ＜0.05。

组别 中性粒细胞 嗜酸性粒细胞 淋巴细胞空白组（n=10） 45.88±1.91 0.42±0.13 29.95±2.53模型组（n=10） 59.12±1.95* 1.19±0.38* 37.70±1.34*柚皮素低剂量组（n=10）57.25±4.15 0.98±0.30 33.30±1.74柚皮素高剂量组（n=10）52.97±4.01# 0.63±0.29# 31.99±1.52#

3 讨论

吸烟是慢性肺病的主要诱因。与其他慢性肺病相比，COPD 在吸烟者或长期吸入烟雾人群中的总体发病率更高[8]。有研究指出，孕妇在孕期接触香烟烟雾对胎儿的发育有害[9]。相关的研究表明，吸烟会促使淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在呼吸道内聚集，诱导促炎细胞因子的释放，进而可引起气道炎症反应，加重呼吸道及肺脏细胞的损伤，严重时可诱发COPD[10]。COPD 患者的主要临床表现为不可逆性呼吸气流受限。进行肺功能检测是临床上诊断COPD 的主要手段[11]。本研究使用FVC、FEV1、PEF这三种肺功能指标评价COPD 大鼠模型的肺功能及为其使用柚皮素的效果，结果发现，与空白组大鼠相比，模型组大鼠的FVC、FEV1、PEF 均较低，P＜0.05。这与相关研究的结果一致[12]。与模型组大鼠相比，柚皮素高剂量组大鼠的FVC、FEV1、PEF 均较高，P＜0.05；柚皮素低剂量组大鼠与模型组大鼠的FVC、FEV1、PEF 相比，P＞0.05。这表明，高剂量的柚皮素能显著提高COPD 大鼠模型的肺功能，而低剂量的柚皮素对其肺功能的改善效果不明显。目前，临床上对COPD 的发病机制尚未完全阐明。但有研究发现，在COPD 发生发展的过程中，促炎细胞因子起着重要的作用。这些细胞因子可对肺脏结构造成破坏，导致肺脏功能丧失[13]。本研究发现，模型组大鼠的肺脏组织出现大面积坏死，肺泡与支气管结构被严重破坏，这正是造成其肺功能下降的原因。无论是进行病理学检查还是肺泡灌洗液细胞计数的结果都显示，模型组大鼠的肺脏组织中存在大量的中性粒细胞与淋巴细胞，这些炎性细胞可导致促炎细胞因子的大量释放，从而可造成肺脏的结构性损伤。笔者认为，高剂量的柚皮素能减少肺脏中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量，从根本上清除促炎因子产生的源头，同时修复已经损坏的支气管与肺泡结构，为肺功能的恢复创造有利条件。

综上所述，高剂量的柚皮素能减少COPD 大鼠模型肺脏中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数量，修复其被破坏的肺脏结构，改善其肺功能。