黄芪、紫锥菊、当归等中药组方对鸡免疫功能的影响

■华诗卉 周柏汝 张延龙 姜承言 姚瑞珂 李敬双 于 洋

（锦州医科大学，辽宁锦州 121001）

免疫增强剂是一些单独使用即能引起机体出现短暂的免疫功能增强作用的物质，有的与抗原同时使用。在畜禽生产中常将免疫增强剂与疫苗同时使用，以达到增强免疫功能、延长免疫时间的效果[1]。目前常用的免疫增强剂主要是化学性免疫增强剂，其药物残留量大，易影响食品安全。中药免疫增强剂药物残留量小，安全性高，特别是复方中药免疫增强剂通过药物配伍药效更佳，越来越受到科研人员的重视。

黄芪、紫锥菊、当归、枸杞、金银花、熟地和甘草都是我国传统的中药，广泛应用于医学和兽医临床。本研究根据单味中药的性能和功效，按照中医理论，辨症施治的原则进行组方，添加雏鸡日粮中。检测中药组方对新城被病毒（NDV）抗体效价、免疫器官指数、脾淋巴细胞增殖、脾淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和坏死因子-α（TNF-α）的影响。为复方中药免疫增强剂的开发和在饲料添加剂中的应用奠定基础。

1 材料

1.1 试验动物

1 日龄海兰褐公鸡雏，由锦州鸿强牧业有限公司提供。

1.2 疫苗

鸡新城疫弱毒疫苗，辽宁省益康生物股份有限公司生产，批号19306002。

1.3 药品

当归（产地甘肃岷县）；黄芪、枸杞和甘草（产地甘肃省宁夏）；紫锥菊（产地河北省保定）；金银花（山东省平邑县）；熟地（河南省焦作）；盐酸左旋咪唑粉（四川省飞天动物药业有限公司生产，批号200901）。

1.4 主要试剂

IL-4和TNF-α试剂盒（武汉纯度生物科技有限公司生产）；鸡新城疫病毒血凝抑制试验（HI）抗原（中国兽医药品监察所生产）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）、RPMI-1640培养液、胎牛血清（FBS）、氯化铵（NH4Cl）和三羟甲基氨基甲烷（Tris）（北京索莱宝科技有限公司生产）；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、台盼蓝（Trypan Blue），上海展云化工有限公司生产。

2 方法

2.1 复方中药的制备

黄芪、紫锥菊、当归、枸杞、金银花、熟地和甘草按质量分数，分别占30%、20%、10%、10%、10%、10%和10%，每味中药用中药粉碎机充分粉碎后过80 目筛，按比例混合装袋备用。

2.2 试验动物分组与饲养方法

试验设5 个组，1 组为空白对照组，2 组为阳性对照组，3、4 组和5 组分别为添加不同浓度复方中药组。每组30只鸡雏，自由采食、饮水，7日龄用鸡新城疫弱毒疫苗进行免疫，操作按照疫苗说明书进行，按说明书2倍用量。1组饲料不加药物，2组在饲料中加盐酸左旋咪唑粉（0.1 g/kg），3、4 组和5 组在饲料中加入不同浓度（5、10 g/kg和15 g/kg）复方中药。

2.3 NDV抗体效价的检测

28 日龄，每组随机抽取20 只鸡，采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测NDV抗体效价，按照姚火春[2]方法操作。

2.4 免疫器官指数的检测

28 日龄，每组随机抽取20 只雏鸡，检测胸腺、法氏囊和脾脏指数，按照李金凤等[3]的方法操作。

2.5 脾淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的检测

28 日龄，每组随机抽取5 只雏鸡，无菌操作取出脾脏分离淋巴细胞，制成淋巴细胞悬液，MTT 法检测脾淋巴细胞增殖，ELISA 法检测IL-4 和TNF-α的分泌，按照仇真毓等[4]试验方法操作。

2.6 统计学分析

数据用“平均数±标准差（x±S）”表示，用统计软件SPSS 13.0进行一维方差分析组间差异。小写字母表示差异显著P<0.05，大写字母表示差异极显著P<0.01。

3 结果与分析

3.1 复方中药对NDV抗体效价的影响(见图1)

图1 复方中药对NDV抗体效价的影响

由图1可知，1组NDV抗体效价极显著低于2 组、3 组和4 组（P<0.01），显著低于5 组（P<0.05），2 组与4 组之间差异不显著（P>0.05），表明复方中药能够提高NDV抗体效价，4组效果最佳。

3.2 复方中药对免疫器官指数的影响(见图2)

由图2可知，1组胸腺指数、法氏囊指数和脾指数均极显著低于2、3、4、5 组（P<0.01），胸腺指数2 组与3、4 组差异均不显著（P>0.05），法氏囊指数和脾指数2 组与4 组差异不显著（P>0.05），表明复方中药能够促进免疫器官的发育，4组效果最佳。

图2 复方中药对免疫器官指数的影响

3.3 复方中药对脾淋巴细胞增殖的影响(见图3)

由图3 可知，1 组脾淋巴细胞刺激指数均极显著低于2、3、4、5 组（P<0.01），2 组与4 组差异不显著（P>0.05），表明复方中药能够促进脾淋巴细胞增殖，4 组效果最佳。

2.4 复方中药对脾淋巴细胞细胞因子分泌量的影响(见图4)

图4 复方中药对脾淋巴细胞细胞因子分泌量的影响

由图4 可知，1 组IL-4 和TNF-α分泌量均极显著低于2、3、4、5 组（P<0.01），IL-4 分泌量2 组与4 组差异不显著（P>0.05），TNF-α分泌量2 组与3、4 组差异不显著（P>0.05），表明复方中药能够促进脾淋巴细胞IL-4和TNF-α的分泌，以4组效果最佳。

4 讨论

4.1 复方中药免疫调节作用效果分析

黄芪、紫锥菊、当归、枸杞、金银花、熟地和甘草都是我国传统的中药。黄芪可以补气升阳，主要成分含有多糖类、黄酮类和三萜类等，具有增强免疫、抗肿瘤、抗病毒等功效[5]。紫锥菊被西方国家称为万能的免疫草药，主要成分含有多糖类、黄酮类和多酚类等，成为国际上热门的免疫促进剂和免疫调节剂[6]。当归为补血之圣药，主要成分含有挥发油、有机酸、多糖、黄酮等，具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化等功效[7]。枸杞可以补气强精，滋补肝肾，主要成分是枸杞子色素，具有提高机体免疫力、抗炎等作用[8]。金银花清热解毒，凉散风热，主要含有黄酮类、绿原酸类和皂苷类等成分，被誉为“清热解毒之良药”[9]。熟地可以补肾填精，养血滋阴，主要成分是多糖、5-羟甲基醛糖和氨基酸，具有抗氧化、增强免疫力、抗肿瘤等功效[10]。甘草可以补脾益气，清热解毒，主要成分含有多糖类、黄酮类和三萜类等，具有增强免疫、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等功效[11]。本研究按照中医和中兽医理论，辨症施治的原则，依据黄芪、紫锥菊、当归、枸杞、金银花、熟地和甘草的性能与功效，按质量分数分别占30%、20%、10%、10%、10%、10%和10%进行组方，达到补气升阳、补肾填精、健脾养血、强筋健骨、清热解毒的效果，从而发挥免疫功效。

4.2 复方中药对鸡免疫功能的影响

4.2.1 复方中药对NDV抗体效价的影响

抗体效价的高低直接反应机体的体液免疫状态[12]。靳双星等[13]利用黄芪、板蓝根、连翘、茯苓、山楂、枳实和白术制成复方中药合剂，利用7、10日龄和14 日龄未免疫AA 肉鸡，各日龄均设复方中药制剂低、中、高剂量组（饮水中加入5、10 mL/L和15 mL/L），连用21 d。7、10日龄和14日龄的鸡分别用NDClone-30 疫苗滴、鼻点眼，ND 油乳剂灭活苗颈部皮下注射，IBD疫苗滴口。21、28日龄和35日龄采用琼脂扩散沉淀反应测定抗体效价，结果复方中药制剂能提高NDV和IBDV 抗体效价。本研究结果复方中药能够提高NDV 抗体水平，与上述结果是一致的，说明复方中药可以调节机体的体液免疫功能。

4.2.2 复方中药对脾淋巴细胞功能的影响

淋巴细胞是机体重要的免疫活性细胞，只有受到抗原刺激才能活化。细胞分裂增殖、产生抗体和分泌细胞因子是淋巴细胞活化的重要标志。淋巴细胞增殖是衡量机体免疫调节功能强弱的重要指标[14]。顾欢欢等[15]用42日龄肉鸡分离脾淋巴细胞，用淫羊藿多糖选用5 个浓度（1 500.00、1 250.00、625.00、312.50 μg/mL和156.25 μg/mL）单独和协同脂多糖（LPS）刺激，用MTT法测定淋巴细胞增殖率，结果淫羊藿多糖可刺激脾脏淋巴细胞增殖。IL-4是Th2型细胞因子，诱导幼稚辅助性T细胞分化成Th2细胞[16]，对疫苗免疫应答具有调节作用，是衡量疫苗免疫的重要指标[17]。TNF-α是Th1型细胞因子，影响细胞的正常生长、增殖、分化和凋亡，从而影响机体的免疫调节活性功能[18]。靳二辉等[19]将女贞子、枸杞、当归、金银花、熟地、淫羊藿和黄芪粉碎制成复方制剂，应用于1日龄AA肉仔鸡，复方制剂设3个剂量组（日粮中添加5、1 g/kg和1 g/kg），21 和42 日龄ELISA 法检测血清中细胞因子的分泌，结果表明复方制剂能够促进INF-γ、IL-4 和IL-12 的分泌。仇真毓等[4]将洋葱槲皮素添加到雏鸡日粮中，洋葱槲皮素设4个不同浓度组（1、2、4 g/kg和8 g/kg），30日龄ELISA法检测TNF-α的分泌，结果洋葱槲皮素能够促进TNF-α的分泌。本研究结果复方中药能够刺激脾淋巴细胞增殖，促进脾淋巴细胞IL-4 和TNFα的分泌，与上述结果是一致的，说明复方中药能够活化淋巴细胞，从而发挥淋巴细胞的免疫调节活性。

4.2.3 复方中药对免疫器官发育的影响

免疫器官的重量可用于评价雏鸡的免疫状态[20]。吕树臣等[21]将黄芪、黄柏、甘草、防风和蒲公英按不同百分比（25%、25%、10%、10%和20%）制成复合型中药添加剂，用21 日龄贵妃鸡，复合型中药添加剂设3 个剂量组（日粮中添加5、10 g/kg 和15 g/kg），试验期为91 d，结果复合型中药添加剂能够提高鸡胸腺、法氏囊和脾的重量。本研究结果复方中药能够提高胸腺、法氏囊和脾指数，与上述结果是一致的，说明复方中药能够促进免疫器官的发育，从而提高机体的免疫功能。

5 结论

复方中药能够促进鸡抗体的产生，促进免疫器官的发育，刺激脾淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌，从而提高鸡的免疫功能，10 g/kg的添加量效果最佳。