饲粮中添加不同生长期山野豌豆缩合单宁对延边黄牛瘤胃微生物发酵特性的影响

■黄小乘 吕忠蕾 田怡豪 王宣力 李成云，2，3*

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133002；2.延边大学肉牛科学与产业技术协同创新中心，吉林延吉 133002；3.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002）

缩合单宁（condensed tannins, CT）又称为原花色素，是羟基黄烷-3-醇和羟基黄烷-3，4-醇，通过C4-C8 或C4-C6 的C-C 键缩合而成的缩合物[1]。许多豆科牧草，如山野豌豆、短花百脉根、红豆草等以及分布在热带、亚热带的灌木、乔木等都含有缩合单宁[2]。反刍动物采食适量的缩合单宁（2%～4% DM）可防止膨胀病的发生，减缓反刍动物瘤胃微生物对蛋白质降解的速度，提高豆科牧草的利用率和营养品质[3]。植物中缩合单宁会受到植物的品种、植株的部位、成熟度、生长季节和土壤肥力、温度、水分和光照等多种因素的影响[4-5]，而不同的缩合单宁对瘤胃发酵特性的影响不同。山野豌豆广泛分布在欧洲、非洲及亚洲各地，其适口性好、生物量高、营养丰富、含有丰富的蛋白质及适量的缩合单宁，牛、马、羊、骆驼等都喜欢采食[6]，是一种品质优良的牧草。而目前关于山野豌豆中缩合单宁利用的报道比较少见。

本试验对不同生长期山野豌豆中缩合单宁含量进行了测定,并通过在饲粮中添加不同生长时期山野豌豆缩合单宁，研究其对延边黄牛瘤胃微生物发酵特性的影响，探讨不同生长期山野豌豆缩合单宁对反刍动物过瘤胃蛋白保护效果及防止膨胀病等功能，以期为山野豌豆缩合单宁在反刍动物生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山野豌豆来源于延边长白山地区，分别在2020年7 月3 日、8 月6 日也就是山野豌豆的初花期、盛花期采集，采集后立即放置-80 ℃条件下保存；委托延边大学草仙药业有限公司对不同生长期山野豌豆中的缩合单宁进行工业化大量提取，所得山野豌豆缩合单宁粗提品纯度为34.2%。

1.2 试验动物与试验饲粮

从吉林省龙井市海兰江牧场选用9 头健康无病的延边黄牛公牛，平均体重（502.3±28.3）kg，均安装永久性瘤胃瘘管。基础日粮参照美国NRC（2000）饲养标准配制。日粮配方及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 饲养管理与试验设计

每天07:00、16:00进行定时饲喂、自由饮水，试验期间保证饲养环境一致。试验持续35 d，其中预试期15 d，正试期20 d。正试期第20 d 饲喂前、饲喂后1、3、6、9 h 采集瘤胃液，进行延边黄牛瘤胃微生物发酵指标—pH、氨态氮（NH3-N）含量、挥发性脂肪酸（VFA）含量、微生物蛋白（MCP）浓度的测定，并利用实时定量荧光PCR（Real time PCR）测定延边黄牛瘤胃总菌及溶纤维丁酸弧菌数量。

将9头延边黄牛随机分为3组，其中对照组饲喂不添加山野豌豆缩合单宁提取物的基础饲粮，初花期组饲喂添加了1%初花期山野豌豆缩合单宁提取物的基础饲粮，盛花期组饲喂添加了1%盛花期山野豌豆缩合单宁提取物的基础饲粮，每组每个时间点设3个重复。

1.4 试验方法

1.4.1 样品采集

冷冻干燥后的草粉粉碎，过40 目筛，做好标记，用于缩合单宁含量的测定；正试期第20 d 进行采样，分别在进食前（6:00）与进食后1、3、6 h 和9 h（8:00、10:00、13:00和16:00），从各组延边黄牛的瘤胃采集内容物，充分混匀并用12层纱布过滤后，分别装入按照试验设计编号的50 mL 离心管中，迅速放入-80 ℃超低温冷冻箱中冷冻保存备用。

1.4.2 缩合单宁含量的测定

取粉碎样品0.1 g，采用香兰素盐酸法（Vanilli-HCl）测定不同生长期山野豌豆缩合单宁的含量[7]。

1.4.3 瘤胃微生物发酵指标的测定

pH 使用酸度计（雷磁pHS-3C）对采集的瘤胃液进行即时测定；NH3-N 利用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定；采用气相色谱法测定VFA[8]；MCP 的测定参照三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白法[9]，其中，蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×D280-0.74×D260）×稀释倍数。

1.4.4 瘤胃总菌、溶纤维丁酸弧菌的分析

取瘤胃液样品，采用反复冻融法提取瘤胃液中的DNA[10]。然后对目标片段进行普通PCR扩增，反应体系为：10×Buffur 2.50 μL，10 mmol/L 的dNTP 2.00 μL，10 μmol/L 的引物各1.50 μL，模板2.50 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，去离子水14.75 μL，总体积25.00 μL；总菌反应参数：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min；溶纤维丁酸弧菌反应参数：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

之后设计目标菌种的引物，在GenBank上分别查找菌种的16S rDNA 序列，然后利用DNASTRAR 中的MegAlign 进行序列比对，寻找种内保守区域，利用Primer express 5.0 进行引物设计，并通过GenBank 中BLAST检测引物的特异性。目标菌株的引物见表2。

表2 总菌、溶纤维丁酸弧菌的引物

实时定量PCR 反应体系：SYBR®Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(2×)10.00 μL；PCR 上游引物（10 μmol/L）0.40 μL；PCR 下游引物（10 μmol/L）0.40 μL；ROX参比染料（50×）或ROX参比染料Ⅱ（50×）×2 0.40 μL；DNA 模板×3 2.00 μL；去离子水6.80 μL；共计20.00 μL。

两步法PCR 扩增标准程序：预变性：95 ℃30 s，循环1 次；PCR 反应：95 ℃40 s，60 ℃30～34 s，循环40次。

根据下列公式将瘤胃微生物目标菌数量表达式公式为：2-ΔΔCt=2-(ΔCt-ΔCtcb)，2-ΔΔCt是目标菌的初始模板量，ΔCt为目标菌引物所测的Ct值，ΔCtcb 为内参模板的引物所测的Ct值。

1.5 数据处理

数据均采用Excel 软件进行数据预处理，然后用SPSS 19.0 软件中单因素方差分析过程（one-way ANOVA）进行统计，均值的多重比较采用LSD和Dun⁃can’s法进行分析，数据均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同生长期山野豌豆缩合单宁含量（见表3）

表3 不同生长期山野豌豆缩合单宁含量(g/kg DM)

如表3所示，山野豌豆缩合单宁含量为36.482 7～38.261 1 g/kg DM，且盛花期缩合单宁含量更多。

2.2 不同生长期山野豌豆缩合单宁对延边黄牛瘤胃微生物发酵特性的影响

2.2.1 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃pH的影响（见表4）

由表4可知各组的pH随发酵时间呈先降低后升高的趋势，其中饲喂之前pH 最高，饲喂后1 h 开始降低，饲喂后3 h达到最低，然后开始升高。在饲喂后1 h时，盛花期组延边黄牛瘤胃pH 显著高于对照组和初花期组（P<0.05），在饲喂后6 h和9 h时，初花期组、盛花期组pH显著高于对照组（P<0.05），初花期组、盛花期组之间pH差异不显著（P>0.05）。

表4 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃pH的影响

2.2.2 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃NH3-N含量的影响（见表5）

由表5可知各组瘤胃NH3-N的浓度在饲喂后1 h时达到最高，在饲喂后6 h 时达到最低，在饲喂后9 h时略有回升。在饲喂后3、6、9 h 时初花期组、盛花期组瘤胃NH3-N 含量显著低于对照组（P<0.05）。在饲喂后3 h 和9 h 时，瘤胃NH3-N 含量初花期组与盛花期组差异显著（P<0.05）。

表5 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃NH3-N含量的影响（mg/dL）

2.2.3 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃VFA的影响（见表6）

表6 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃VFA含量的影响

由表6 可知各组瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acid, TVFA）的浓度在饲喂后呈先升高后降低的趋势。在饲喂后1 h 时，盛花期组乙酸浓度显著低于对照组和初花期组（P<0.05）；在饲喂后6 h 和9 h 时，初花期组、盛花期组乙酸浓度显著低于对照组（P<0.05），其中，饲喂后6 h时，盛花期组乙酸浓度显著低于对照组和初花期组（P<0.05）。在饲喂前（0 h）时，初花期组、盛花期组丙酸浓度与对照组差异极显著（P<0.01）；饲喂后1 h时，盛花期组与初花期组差异显著（P<0.05）；在饲喂后9 h时，初花期组、盛花期组丙酸浓度显著低于对照组（P<0.05）。在饲喂后9 h时，初花期组、盛花期组丁酸浓度显著低于对照组（P<0.05）。在饲喂前（0 h）时和饲喂后6 h 时，初花期组乙酸/丙酸比值与对照组、盛花期组差异显著（P<0.05），在饲喂后9 h时，差异达到极显著（P<0.01）；在饲喂后1 h和3 h时，初花期组、盛花期组乙酸/丙酸比值极显著低于对照组（P<0.01）。在饲喂前（0 h）时盛花期组TVFA 含量与初花期组、对照组相比差异极显著（P<0.01）；在饲喂后3 h 时，盛花期组TVFA 含量极显著低于初花期组和对照组（P<0.01）。在饲喂后9 h时，初花期组和盛花期组TV⁃FA极显著低于对照组（P<0.01）。

2.2.4 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃MCP的影响（见表7）

表7 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃MCP的影响（mg/mL）

由表7可知，在饲喂后3 h时初花期组、盛花期组瘤胃MCP 显著低于对照组(P<0.05)，初花期组与盛花期组两组之间差异不显著(P>0.05)；饲喂后6 h 时，初花期组与盛花期组瘤胃MCP 显著低于对照组(P<0.05)，并且，初花期组与盛花期组两组之间差异显著(P<0.05)；饲喂后9 h 时，各组瘤胃MCP 差异不显著(P>0.05)。

2.3 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃微生物的影响（见图1、图2、表8）

表8 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃内目标菌数量（目标基因相对表达量）的影响

图1 总菌Real-time PCR扩增曲线

图2 溶纤维丁酸弧菌Real-time PCR扩增曲线

由图1、2可知，总菌和溶纤维丁酸弧菌的扩增动力学曲线光滑，指数期明显，符合计算标准。由表8可知各组的瘤胃总菌数量没有显著差异（P>0.05）。与对照组相比，饲喂不同生长期山野豌豆可以显著降低溶纤维丁酸弧菌数量（P<0.05），盛花期组作用更强。

3 讨论

3.1 不同生长期山野豌豆缩合单宁含量

植物品种、生长期不同，缩合单宁的含量不同[11]。本试验利用香兰素盐酸法测定不同生长期山野豌豆缩合单宁的含量，由于香兰素-盐酸还能与其他植物成分（如二氢查耳酮和花青苷等）发生反应，所以用香兰素盐酸法测得的缩合单宁含量会有点偏高[12]。研究表明，当饲喂的缩合单宁含量超过3%就可能会降低山羊的采食量[13]。在饲粮中添加120 g/kg 缩合单宁，降低了荷斯坦奶牛的干物质采食量[14]。这是由于单宁与唾液蛋白和糖蛋白在口腔中相互作用，会引起收敛感、干燥感、涩味，饲料适口性下降，干物质采食量降低[15]。本试验不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物的添加量为1%，不会引起采食量降低。

3.2 不同生长期山野豌豆缩合单宁对延边黄牛瘤胃微生物发酵特性的影响

不同生长期山野豌豆缩合单宁均使延边黄牛瘤胃内的pH有上升趋势，这是由于缩合单宁可以结合蛋白质，降低蛋白质在瘤胃中的溶解度和表面活性，避免被瘤胃微生物迅速降解，形成了过瘤胃蛋白保护机制[16]，有机酸生成量减少，减缓pH的下降。而盛花期组pH相对较高，可能是由于分子量大的缩合单宁拥有较强的极性，更容易与蛋白质结合[17]，过瘤胃蛋白保护效果更好。Barry等[18]也得到相同结论，发现在同样浓度条件下，缩合单宁分子量越高对饲料蛋白质的保护效果越强。

瘤胃液中氨态氮浓度在一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物质产生氨的速度。反刍动物饲喂高质量牧草时，绝大多数氨态氮以尿素的形式被排出体外[19]，饲料利用率下降。Powell 等[20]研究发现将含有缩合单宁的牧草饲喂反刍动物，饲喂缩合单宁组动物粪氮/尿氮比值显著高于未饲喂缩合单宁组，氮排泄途径发生了改变。Wang 等[21]试验发现饲喂红豆草干草能使羊瘤胃NH3-N浓度显著降低。本试验也获得一致的结果，在饲喂后3、6 h和9 h时，添加不同时期山野豌豆缩合单宁提取物都可以显著降低瘤胃NH3-N 的浓度（P<0.05），起到保护过瘤胃蛋白的作用，其中盛花期组作用更强。

反刍动物机体代谢的碳流量的2/3来自瘤胃发酵产生的VFA，可提供机体需要总能量的70%～80%。本试验发现，在饲粮中添加不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物可以显著降低延边黄牛瘤胃内VFA 浓度（P<0.05）。这是因为在采食后，瘤胃快速发酵，产生大量的乙酸、丙酸、丁酸等，随着时间的推移，VFA 逐渐被瘤胃微生物利用及被瘤胃壁吸收，浓度下降[22]。而缩合单宁有抑制瘤胃微生物生长以及抵抗生物降解的能力，所以瘤胃细菌、原虫和真菌等微生物对粗纤维、淀粉等碳水化合物的降解也被抑制，VFA 含量的降低，可以有效预防反刍动物瘤胃酸中毒[23-24]。Slianikove等[25]用含缩合单宁的白坚木、角豆树等饲喂发现，瘤胃液中VFA 浓度降低（P<0.05），与本试验的研究结果一致。

在饲粮中添加不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物使得延边黄牛瘤胃MCP浓度降低（P<0.05），这是因为瘤胃内微生物蛋白质的合成主要取决于瘤胃内碳水化合物和氮的利用效率，而缩合单宁可以保护过瘤胃蛋白，蛋白质与缩合单宁形成复合物，微生物可以利用的氮源含量降低，使得微生物蛋白质合成量和生产效率降低[26]。虽然NH3-N的浓度降低对MCP的合成产生影响，但Slyter[27]认为微生物正常生长对氨浓度耐受的临界范围是0.35～29.00 mg/dL之间，本试验NH3-N的浓度在此范围内，因此可以排除NH3-N的浓度影响。

3.3 不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物对延边黄牛瘤胃微生物的影响

溶纤维丁酸弧菌是一种严格厌氧型革兰氏阳性菌，不仅具有蛋白降解酶活性，还有生物氢化的作用，乙酸和丁酸都是其发酵主要产物[28]。在饲粮中添加不同生长期的山野豌豆缩合单宁提取物均显著降低了瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的数量（P<0.05），且瘤胃中乙酸和丁酸浓度降低也可以一定程度上反应出缩合单宁对溶纤维丁酸弧菌的抑制。研究表明，在绵羊饲粮中添加2%的缩合单宁，显著降低了瘤胃中总细菌和溶纤维丁酸弧菌的数量[29]。据Min[30]报道，当在绵羊饲粮中添加含缩合单宁的百脉根（缩合单宁32 g/kg DM），瘤胃丁酸弧菌数量减少，与本试验结果一致。通常认为，单宁能够抑制微生物生长。虽然单宁对瘤胃微生物有较强的抑制作用，但仍有很多微生物通过不同的方式适应单宁对其的影响，如分泌聚合物与单宁结合以减少单宁对微生物的影响[31]。Animut等[32]在山羊饲粮中添加神户胡枝子单宁，发现细菌总数没有受到影响。在本试验中，在饲粮中添加不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物，瘤胃总菌的数量与对照组相比没有显著差异（P>0.05），证明添加不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物不会影响瘤胃微生物的整体环境。

4 结论

山野豌豆在不同生长期，缩合单宁含量不同，且盛花期山野豌豆缩合单宁含量更多。在饲粮中添加不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物均使延边黄牛瘤胃内的pH有上升趋势，使NH3-N、MCP和VFA的浓度有下降趋势。在饲粮中添加不同生长期山野豌豆缩合单宁提取物均对延边黄牛瘤胃内溶纤维丁酸弧菌有抑制作用，对瘤胃总菌没有影响。证明山野豌豆缩合单宁有保护过瘤胃蛋白、预防酸中毒的作用，且盛花期山野豌豆缩合单宁保护过瘤胃蛋白的效果更好。