基于数据挖掘及网络药理学方法探讨肝郁脾虚型功能性消化不良用药规律及机制研究

张新雨 ，范梦月，孙 蓉,

1.山东中医药大学，山东 济南 250355

2.山东大学第二医院，山东 济南 250033

3.山东大学高等医学研究院，山东 济南 250012

4.天津中医药大学，天津 301617

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）是指胃和十二指肠功能紊乱引起的餐后饱胀感、早饱、中上腹疼痛和中上腹灼烧感等症状，而无器质性病变的一组临床综合征，其发病机制复杂，发病率高，而且患者反复发作，严重影响生活质量，并消耗了大量的医疗资源，已成为现今国内外学者研究的热点及难点之一[1-3]。FD根据其临床症状，在中医学上将其归为“胃脘痛”“痞满”等范畴[4]。中医药作为FD的药物治疗途径之一，对其临床症状及体征有明显改善，而且对于其防治具有缩短病程、降低复发率、毒副作用小、适合长期服用的特点[5]。但是治疗FD的各类成方、自拟方存在用药多样化以及个性化问题，难以掌握各药物之间的配伍关系，给中医药的用药经验传承带来困难。虽然前期已有研究人员对中医药治疗FD用药规律进行分析，但并未对其分析出的核心药物进行潜在机制研究且搜集的处方年份不全[6-7]。近年来关于中医药治疗FD的报道逐年增多，各医家对FD的辨证分型以肝郁脾虚、肝胃不和最为常见，且肝郁脾虚为FD的主要病机[8-9]。因此，本研究通过数据挖掘联合网络药理学的方式，选择FD的重要证型肝郁脾虚为研究对象，分析总结中医药在治疗肝郁脾虚型FD的用药特点及核心药物的潜在作用机制，以期更好地为肝郁脾虚型FD的临床用药以及新药研发提供依据，并从组方用药规律和功效网络构建联合角度阐释“理-法-方-药”一致性的科学性。

1 资料与方法

1.1 数据来源

以“功能性消化不良”“肝郁脾虚”为检索词，在中国知网（CNKI）、维普、万方数据库检索相关文献，检索自建库至2020年11月30日的文献。

1.2 纳入标准

①文献为临床试验研究；②文献需为中药复方治疗肝郁脾虚型FD；③文献中处方完整，中药组成及用药剂量明确；④用药方式为口服。

1.3 排除标准

①动物实验类文献；②处方不完整，用药剂量不明确的文献；③重复发表的文献。

1.4 数据处理

将收集到中药的名称、功效以及性味归经参考《中国药典》2020年版以及“十三五”规划教材《中药学》进行标准化处理。如川楝、川楝子统一为川楝子，云苓、茯苓统一为茯苓，延胡索、元胡统一为延胡索，生半夏、清半夏、姜半夏统一为半夏。

1.5 肝郁脾虚型FD用药规律分析

将规范处理好的中药复方输入Excel中，使用IBM SPSS Statistics 25、IBM SPSS Modeler 18以及Gephi进行性味归经、药物使用频次、用量、聚类、关联规则、复杂网络等分析和可视化处理。

1.6 网络药理学机制研究

结合“1.5.1”项下频数统计、关联规则以及聚类分析结果得到核心药物，在中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[10]收集核心药物化学成分，并基于口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18进行筛选，同时结合文献报道对筛选后的成分进行补充，最终确定其活性成分，通过TCMSP数据库查询活性成分相对应的靶标蛋白，并利用Uniprot数据库（http://www.unitprot.org/）查询靶标蛋白对应的基因名称，剔除非人类的靶点蛋白，最终确定高频药对的活性成分及其对应靶点[10]。同时在 GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库中输入关键词“functional dyspepsia”，收集疾病的相关靶标，在DrugBank（https://www.drugbank.ca/）中检索治疗FD的一线药物，获取对应靶标，将所得靶标取并集，去除重复项得到FD的相关靶标信息。在药智网数据库检索疏肝健脾的中药方剂以及中成药，结合TCMSP以及文献报道，收集其对应中药的化学成分及其对应靶点，并根据肝郁脾虚的临床主要表型“胸胁作痛、情志抑郁、腹胀、便溏”为检索词在HPO数据库（https://hpo.jax.org/app/）检索相关靶点，两者合并得到肝郁脾虚证相关靶点。将肝郁脾虚证和FD靶标进行映射，得到肝郁脾虚型FD的靶点[11]。将高频药对的靶点与肝郁脾虚型FD的靶点进行匹配，得到高频中药治疗肝郁脾虚型FD的关键靶点。利用Cytoscape构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，采用STRING平台（https://string-db.org/）、DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对关键靶点进行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 文献纳入情况

以“肝郁脾虚”“功能性消化不良”为检索词，在中国知网、维普、万方数据库经过合并去重后，共得到文献606篇，根据本研究的纳入和排除标准筛选后，得到文献207篇。

2.2 性味归经分析

207个处方中共有119味中药，依据《中国药典》2020年版和《中药学》的分类标准，对纳入中药的药性药味以及归经进行统计分析，结果显示药性以温（34.29%）、平（31.34%），微寒（22.80%）为主；药味以苦（49.71%）、辛（47.14%）、甘（43.41%）为主；归经以脾（72.68%）、胃（48.30%）、肺（37.85%）、肝（30.85%）为主。

2.3 药物使用频次分析

使用频次≥15的药物共有30味，见表1。其中出现频次较高的中药分别为柴胡、白术、甘草、茯苓、白芍、党参、陈皮、半夏、枳壳和木香。

表1 治疗肝郁脾虚型FD高频药物使用情况 (频次≥15)Table 1 High-frequency drugs for treating FD with liver depression and spleen deficiency (frequency ≥ 15)

2.4 用量分析

对使用频次排名前5的中药（柴胡、白术、甘草、茯苓、白芍）进行用量统计分析，结果见图1。由图1可知，柴胡的最大剂量为25 g，最小剂量为5 g，10 g为柴胡的临床常用剂量；甘草使用频次最高的剂量为6 g；白术和茯苓的最大剂量均为30 g，使用频次最高的均为15 g；白芍的最大剂量为40 g，使用频次最高的剂量为15 g，10 g次之[12]。

图1 药物用量分析 (频次排名前5)Fig.1 Analysis of drug dosage (top 5 in frequency)

2.5 关联规则分析

将数据整理成0和1的格式，即用了这味药物标记为1，没用这味药物标记为0。通过源节点，导入IBM SPSS Modeler 18软件中，将数据类型选择为标记，角色为二者，与图选项板下的网络节点相连接，选择所有药物，按照连接强度为低、中、高进行绘图，制作出网络图，见图2，其中连线的粗细代表关联强度大小，由图可见，柴胡、甘草、白术、茯苓、白芍具有较强相关性，在治疗肝郁脾虚型FD的中药处方中经常共同出现。

图2 治疗肝郁脾虚型FD的中药处方药物关联规则Fig.2 Association rules of traditional Chinese medicine prescription for treatment of FD with liver stagnation and spleen deficiency

在模型选项板下，将Apriori节点与类型节点相连接，按照预定义角色，设置最低支持度10%，最小置信度80%，最大前项为5，对药物进行关联规则分析。根据Apriori算法，一共产生2374条规则，关联规则见表2～4。

表2 常用2种药物组合关联规则Table 2 Association rules of commonly used two drug combination

表3 常用3种药物组合关联规则Table 3 Association rules of commonly used three drug combination

表4 常用4种药物组合关联规则Table 4 Association rules of commonly used four drug combination

2.6 聚类分析

对使用频次≥15的药物进行聚类分析。将数据导入IBM SPSS Statistics 25.0中，选择分析菜单，分类项下的系统聚类，由于预先不知道分类情况，聚类成员设置为5～10类进行探索性分析，连接方式为组间连接，方法为皮尔逊相关系数，生成聚类分析树状图，见图3。从图3可以看出，聚为5类时，结果为类1（柴胡、甘草、白术、茯苓、白芍、陈皮、半夏、枳壳、麦芽、丹参、黄连）；类2（党参、木香、香附、厚朴、鸡内金、枳实、砂仁、神曲、莱菔子）；类3（郁金、佛手、山楂、延胡索）；类4（当归、生姜）；类5（黄芪、黄芩、大枣、干姜）。

图3 药物聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of drug cluster analysis

2.7 复杂网络分析

首先将所有的药物整理成共现矩阵格式，导入Gephi0.9.2软件中。设置布局为 Fruchterman Reingold，区为10 000，重力为10，速度为1，点击运行。在过滤窗口中，设置根据度值的大小决定节点的大小，模块化的类型设置为不同的节点颜色，边的厚度为1，点击刷新即可得到复杂网络图。在数据表窗口中，可以看到复杂网络的各个参数情况。提供软件计算出节点个数、边的个数、平均度、平均加权度、网络直径、网络密度、平均聚类系数、平均路径长度等指标。经过计算，节点数为111，边为1807，平均度为32.559，平均加权度为472.613，网络直径为2，网络密度0.296。总体网络图见图4。

图4 总体复杂网络图Fig.4 Overall complex network diagram

利用K-core分析方法发现药物核心组合。由图5可见，K-core为25以上，白术在网络中心，是非常重要的药物，外围形成了3个环，内环为核心药物，包括柴胡、甘草、半夏、麦芽、茯苓和枳壳。

图5 K-core≥25的复杂网络Fig.5 Complex network with K-core ≥ 25

2.8 网络药理学机制研究

根据频数、关联规则以及聚类分析和复杂网络综合分析的结果，对核心中药柴胡、甘草、白术、茯苓的成分和靶点进行筛选，得到靶点共359个。在GeneCards、PubMed、TTD、DrugBank、OMIM数据库中检索FD的靶点，删除重复项，得到FD相关靶点2499个，HPO检索结果综合疏肝健脾方中药的靶点得到肝郁脾虚证的相关靶点1373个，将FD靶点与肝郁脾虚证靶点取交集，得到肝郁脾虚型FD靶点517个，核心中药靶点与其映射得到中药治疗肝郁脾虚型FD的关键靶点212个。将关键靶点导入String数据库获取PPI网络，见图6。其中得分前10的靶点为蛋白激酶Bα（protein kinase Bα，AKT1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、肿瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、MYC原癌基因蛋白（MYC proto-oncogene，MYC）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、JUN原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN），表明这些基因在核心中药治疗肝郁脾虚型FD中具有重要作用，见图7。利用Cytoscape软件构建“疾病-药物-成分-靶点”网络，见图8，其中槲皮素、山柰酚、甘草次酸、异鼠李素、柚皮素为度（degree）值排名靠前的成分，在发挥治疗肝郁脾虚型FD中有着重要作用。KEGG通路分析结果显示，关键靶点显著富集在癌症相关通路、乙型肝炎、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路、神经活性配体-受体相互作用等通路上，见图9。

图7 核心药物治疗肝郁脾虚型FD关联性排名前10的靶点Fig.7 Top 10 targets in correlation of core drugs for FD with liver depression and spleen deficiency

图8 疾病-药物-成分-靶点网络图Fig.8 Disease-drug-component-target network diagram

图9 KEGG通路富集分析Fig.9 KEGG pathway enrichment analysis

3 讨论

目前，现代医学普遍认为FD与胃肠功能运动障碍、内脏高敏感性、幽门螺旋杆菌感染、胃酸分泌异常、精神心理等多种因素密切相关[13]。西医对FD的治疗主要包括促进胃肠动力、根除幽门螺旋杆菌、抑酸、抗焦虑、抗抑郁等，然而化学药在治疗FD的同时伴有毒副作用，并且停药以后患者容易出现病情反复现象。近年来，中医药在FD实验研究、临床治疗逐渐增加，显示了中医药治疗FD的优势[14]。本研究利用数据挖掘和网络药理学联用的方法，初步探讨了数据挖掘分析得到的核心药物对治疗肝郁脾虚型FD的潜在活性成分和功效作用网络。

将纳入研究的207个处方进行性味归经分析，结果表明中医药在治疗肝郁脾虚型FD的中药药性以温、平、微寒为主，药味以苦、辛、甘为主，归经以脾经、胃经、肺经、肝经为主，FD初起以寒凝为主，病情日久郁而化热或寒热互见[15]，辛温能散寒除痞，苦寒清降泄热开痞，辛开恢复脾的升清功能，甘温可补脾气以和中，苦降可恢复胃的降浊功能，性味的有机结合可奏扶正祛邪之功[16]，FD的病位涉及肝、胃、脾，归经结果可与之相对应且表明在用药时更加注重脾胃的治疗，至于肺经，在五行规律中，肺为脾之子，二者生理上相互为用[17]。药物频次分析显示，其中疏肝理气药（柴胡、陈皮、枳壳）、健脾祛湿药（白术、茯苓、白芍、甘草、党参、木香）、降逆止呕（半夏）使用频次较高，且柴胡入肝经，枳壳、白术入脾、胃经，陈皮、茯苓、党参入脾、肺经，白芍入肝脾经，甘草入肺、脾胃经，木香入肝、脾、胃、肺经，说明在治疗肝郁脾虚型FD时，应以疏肝理气、健脾益气、宣降肺气为主。

关联规则显示，柴胡-白芍，白芍-白术、柴胡，白芍-茯苓、白术、柴胡分别为同一个组里支持度最高的组合，有研究表明，白术挥发油可促进胃肠运动，显著提高小肠推进率，白术内酯I可调节肠管功能，促进肠管吸收，是健脾的重要成分[18]；柴胡可抑制胃酸分泌从而达到保护胃黏膜的作用，柴胡水提液可逆转阿托品引起的胃肠蠕动抑制；白芍总苷可促使三硝基苯磺酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠肠道紊乱恢复[19]；同时茯苓多糖也具有调节胃肠道功能的作用[20-24]。

对频次≥15的药物进行聚类分析，聚类一为疏肝健脾汤加减，具有疏肝解郁、养血健脾的功效[25]；聚类二为加味三香汤，可疏肝理气、健脾益气[26]；聚类三为郁金、佛手、山楂、延胡索，郁金行气解郁，佛手疏肝理气，山楂、延胡索具有理气行气作用；聚类四为当归、生姜，二者配伍可温中补血，现可作为食疗之良方；聚类五为黄芪、黄芩、大枣、干姜，黄芪配大枣补气养血，干姜加黄芩可辛开苦降消痞。

复杂网络分析显示，在治疗肝郁脾虚型FD的中药中，白术、甘草、柴胡、茯苓扮演者重要角色，同时在关联规则、聚类分析当中均有所体现，表明其可作为潜在的中药配伍，为中药复方治疗肝郁脾虚型FD的核心药物。

利用网络药理学的方法得到核心中药治疗肝郁脾虚型FD的重要成分为槲皮素、山柰酚、甘草次酸、异鼠李素、柚皮素等，研究表明槲皮素具有调节胃肠道平滑肌、抗炎以及神经保护的作用[27]，山柰酚可促进NO产生，保护胃黏膜，同时调控雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）发挥抗抑郁作用[28]，甘草次酸具有镇静安定作用[29]。IL-6能激活胃肠道黏膜下层神经元，促进胃肠道蠕动及腺体分泌，研究表明香砂六君子汤改善FD的症状可能与减少相关白介素IL-2、IL-4、IL-6含量、促进胃肠动力的恢复有关[30]，剩余预测的核心中药治疗肝郁脾虚型FD关联性极高的靶点在目前研究中尚未得到明确证实，如MAPK3、AKT1等，这为后续研究其分子作用机制提供新思路。KEGG通路分析显示，核心中药治疗肝郁脾虚型FD的主要通路为癌症相关通路、乙型肝炎、PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用等通路，PI3K/Akt通路在正常细胞增殖、分化、凋亡等细胞生理功能中起着重要的调节作用。实验研究表明，β2-肾上腺受体（β2-adrenergic receptor，β2-AR）/PI3K/Akt通路活化可达到抑制胃肠道平滑肌细胞细胞存活的效果，同时，PI3K/Akt通路也可通过增加初级传入神经元中神经肽和钠通道的产生来调节感觉超敏反应；结肠传入神经元可激活PI3K/Akt通路调节辣椒素受体（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）蛋白的合成，从而介导内脏高敏感神经元兴奋性，胃肠激素可差异性地调节Akt活性，如胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）的浓度变化会引起双重调节，高低亲和力CCKA受体可差异调节PI3K/Akt通路，Ghrelin可通过调节p38 MAPK来调节线粒体凋亡途径改善细胞凋亡[31-36]。神经活性配体-受体相互作用的受体基因主要包括血管活性肠肽受体2（vasoactive intestinal peptide-receptor 2，VIPR2）、

5-羟色胺1B受体（5-hydroxytryptamine receptor 1B，HTR1B）、生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）等，VIPR2在身心应激造成的胃溃疡大鼠模型中显著增加，HTR1B表达下调影响5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的传递从而变现出内脏高敏感，FD大鼠模型的GHSR的表达降低[37-40]，预测结果表明核心中药治疗肝郁脾虚型FD可能与改善脑肠肽水平有关，为进一步实验提供参考。

综上所述，本研究从组方用药规律和功效网络构建联合角度阐释了“理-法-方-药”一致性的科学性，通过对中国知网、万方和维普数据库中关于肝郁脾虚型FD的方剂进行数据挖掘分析，初步揭示了中医药治疗肝郁脾虚型FD的核心药物以及配伍规律，同时得到治疗该病潜在的中药配伍，中药复方治疗肝郁脾虚型FD以疏肝理气、健脾益气为主，网络药理学研究得到核心中药（柴胡、甘草、白术、茯苓）中的槲皮素、山柰酚、甘草次酸等成分作用于IL-6等关键靶点，参与PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用等通路发挥治疗肝郁脾虚型FD的作用，为探讨其作用机制提供科学证据，同时为临床应用的有效性提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突