参芪扶正注射液通过调控miR-29b/Bcl-2通路逆转胰腺癌多药耐药研究

文柳静，张 洁

天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，早期不易诊断，手术预后差[1]。2019年美国癌症协会发布的数据表明，胰腺癌5年生存率为9%，是生存率最低的肿瘤[2]。目前，化疗是治疗胰腺癌的主要手段[3]。但是，肿瘤多药耐药的发生往往导致化疗失败。中药可以逆转胰腺癌的化疗耐药，增加其敏感性[4-6]。随着生物学技术的进步，大量研究显示，微小RNA（microRNA，miRNA）通过降解mRNA或抑制翻译来调控基因表达，从而参与多种生物过程，影响肿瘤的发展、预后以及耐药[7]。miRNA在胰腺癌发生发展中发挥了重要的调节作用[8]。miRNA-155通过提高抗凋亡因子的活性产生化疗药物的耐药性，靶向miRNA-155能够有效降低肿瘤细胞耐药性[9]。过表达miRNA-145-5P能够抑制胰腺导管腺癌PDAC细胞的增殖和侵袭能力，下调B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）表达，表明其与肿瘤的耐药性密切相关[10]。

本课题组前期研究结果显示[11]，参芪扶正注射液能够通过下调人胰腺癌 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）耐药细胞株Patu8988/5-Fu多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）和Bcl-2表达，上调Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）表达，从而逆转Patu8988/5-Fu细胞多药耐药。本研究考察参芪扶正注射液对miR-29b表达的影响以及miR-29b对Patu8988细胞增殖能力的影响，探讨Patu8988/5-Fu耐药细胞中miR-29b模拟物（miR-29bmimics）和miR-29b抑制剂（miR-29binhibitors）对Bcl-2蛋白表达的差异，为参芪扶正注射液逆转胰腺癌多药耐药的机制提供依据。

1 材料

1.1 细胞

人胰腺癌细胞株Patu8988购自南京凯基生物科技发展有限公司

1.2 药品与试剂

参芪扶正注射液（批号190934，250 mL/瓶）购自丽珠集团利民制药厂；RPMI 1640培养基（批号8117203）购自美国Gibco公司；5-Fu（批号1801091）购自天津金耀集团有限公司；特异性引物、Prime Script RT Master Mix和SYBR Premix EX Taq II购自日本 Takara公司；miR-29bmimics、miR-29binhibitors、FECT™ CP转染试剂购自广州市锐博生物科技有限公司；HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（批号9109）购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL超敏发光液（批号1815a01）购自北京普利莱基因技术有限公司；β-actin抗体（批号8457S）、Bcl-2抗体（批号15071）购自美国CST公司。

1.3 仪器

PCR仪购自英国CorBett公司；ImageQuant LAS 4000 mini成像系统购自美国GE公司。

2 方法

2.1 细胞培养和耐药细胞株的建立

Patu8988细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。按课题组前期方法[11]建立Patu8988/5-Fu耐药细胞株，将诱导成功的Patu8988/5-Fu细胞在含20 μg/mL 5-Fu的培养液中培养，取培养5代且处在对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 参芪扶正注射液对 Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

将处于对数生长期的Patu8988/5-FU细胞，以2×105/mL接种于6孔板，培养24 h。设置对照组和参芪扶正注射液（5、10、20 μL/mL）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，分别培养12、24 h，收集细胞。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：miR-29b上游引物5’-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3’，下游引物5’-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下 游 引 物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3 转染miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

将处于对数生长期的Patu8988/5-FU细胞，以2×105/mL接种于6孔板，待细胞融合度达到30%～50%时按照试剂盒说明书进行转染。miR-29bmimics引物序列5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’；miR-29binhibitors引物序列5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’。转染24 h后，按“2.2”项下方法检测Patu8988/5-FU细胞中miR-29bmRNA表达情况。

2.4 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988细胞活力的影响

将处于对数生长期的Patu8988细胞，以4×104/mL接种于96孔板，培养24 h。设置对照组、miR-29bmimics组和miR-29binhibitors组，按照试剂盒说明书将miR-29bmimics和miR-29binhibitors分别转染至细胞内，培养6 d，加入MTT，采用酶标仪测定490 nm波长处吸光度（A）值。

2.5 参芪扶正注射液对Patu8988/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达的影响

将处于对数生长期的Patu8988/5-FU细胞，以2×105/mL接种于6孔板，培养24 h。设置对照组、mimics阴性对照（NC mimics）组、miR-29bmimics组、miR-29bmimics＋参芪扶正注射液（20 μL/mL）组、抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）组、miR-29binhibitors组、miR-29binhibitors＋参芪扶正注射液（20 μL/mL）组，按照试剂盒说明书将miR-29bmimics、miR-29binhibitors及相应对照分别转染至细胞内，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h，收集细胞。加入裂解液，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入Bcl-2、β-actin抗体（1∶1000），室温孵育1 h后，4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（1∶200），室温孵育1 h，加入ECL超敏发光液显影，采用ImageQuant LAS软件成像。

2.6 统计学方法

数据以±s表示，采用SPSS 13.0软件中单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计分析。

3 结果

3.1 参芪扶正注射液对 Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

如图1所示，与对照组比较，参芪扶正注射液（20 μL/mL）作用于Patu8988/5-Fu细胞12 h，显著上调miR-29bmRNA表达水平（P＜0.001）；参芪扶正注射液（5、10、20 μL/mL）作用于Patu8988/5-Fu细胞24 h，均显著上调miR-29bmRNA表达水平（P＜0.05、0.01、0.001）。

图1 参芪扶正注射液作用12 h 和24 h 对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响Fig.1 Effect of Shengqi Fuzheng Injection on miR-29b mRNA expression in Patu8988/5-Fu cells for 12 h or 24 h

3.2 转染miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

如图2所示，与NC mimics组比较，miR-29bmimics组miR-29bmRNA表达水平显著升高（P＜0.001）；与anti-miR-NC组比较，miR-29binhibitors组miR-29bmRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。

图2 转染miR-29b mimics (A) 和miR-29b inhibitors (B) 对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响Fig.2 Effect of transfection of miR-29b mimics (A) and miR-29b inhibitors (B) on miR-29b mRNA expression in Patu8988/5-Fu cells

3.3 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988细胞活力的影响

如图3所示，与对照组比较，miR-29bmimics组细胞活力显著降低（P＜0.05），miR-29binhibitors组细胞活力显著升高（P＜0.01），表明miR-29b能够抑制Patu8988细胞增殖，具有抗肿瘤作用。

图3 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988细胞活力的影响Fig.3 Effect of miR-29b mimics and miR-29b inhibitors on viability of Patu8988 cells

3.4 参芪扶正注射液对Patu8988/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，miR-29bmimics组Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），miR-29bmimics＋参芪扶正注射液组Bcl-2蛋白表达进一步降低（P＜0.05）；miR-29binhibitors组Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），miR-29binhibitors＋参芪扶正注射液组Bcl-2蛋白表达水平无明显变化。

图4 参芪扶正注射液对Patu8988/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Shengqi Fuzheng Injection on Bcl-2 expression in Patu8988/5-Fu cells

4 讨论

参芪扶正注射液由党参和黄芪配比而成，党参多糖和黄芪中的多糖、皂苷、黄酮等成分均具有免疫调节作用。参芪扶正注射液对胰腺癌Mia-PaCa-2细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、非小细胞肺癌细胞等多种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，并能够有效逆转多药耐药，其作用机制与调控多种相关基因、蛋白有关[12-15]。

miRNA是一类调控性的小分子非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3’非编码区结合调控基因表达。miRNA参与肿瘤的多种生物学和生理过程[16-17]。miR-29b作为miRNA中的重要一员，发挥了重要的抑癌作用[18]。miR-29b具有调控多种下游信号通路和靶基因的作用[19-20]。miR-29b的靶基因是促凋亡因子Bcl-2修饰因子（Bcl-2 modifying factor，BMF），miR-29bmimics可以显著降低BMF基因和蛋白表达水平[21]。过表达人单核白细胞系THP-1中miR-29b能够显著抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡[22]。miR-29b能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移，Rhotekin蛋白（recombinant rhotekin，RTKN）可能是miR-29b调控乳腺癌细胞生物学行为的新靶点[23]。埃布尔森小鼠白血病病毒癌基因1（abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1，ABL1）和断裂点簇集区（breakpoint cluster region，BCR）是miR-29b的靶点，过表达红白血病K562细胞中miR-29b能够抑制细胞生长和集落形成能力，从而诱导细胞凋亡[24]。纹蛋白4（striatin 4，STRN4）是miR-29b的靶点，下调miR-29b可以提高非小细胞肺癌NSCLC细胞中STRN4表达水平，调控miR-29b/STRN4通道可以抑制细胞增殖并延缓肿瘤扩散[25]。miR-29b在非小细胞肺癌患者癌组织中表达水平显著降低，过表达miR-29b可以抑制肺癌A549细胞增殖，可能为肺癌靶向药物研发的一个新靶点[26]。

Bcl-2是重要的抗凋亡基因，与多种肿瘤的发生发展相关。上调Bcl-2/Bax可以抑制化疗药物引起的细胞凋亡，进而参与肿瘤细胞化疗耐药性的形成[27]。研究表明，miR-29b不仅参与细胞增殖和诱导细胞凋亡，而且通过调控Bcl-2表达水平或Bcl-2/Bax，逆转肿瘤多药耐药[28-29]；miR-29b可以通过下调Bcl-2表达水平促进肿瘤细胞凋亡[30]；LINC00511通过miR-29b下调Bcl-2表达水平并上调Bax表达水平，抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，逆转宫颈癌对紫杉醇的耐药性[31]。本研究结果显示，miR-29bmimics组Patu8988细胞活力显著降低，miR-29binhibitors组Patu8988细胞活力显著升高，表明miR-29b可以抑制Patu8988细胞增殖；参芪扶正注射液显著上调Patu8988/5-Fu细胞miR-29bmRNA表达，miR-29bmimics显著降低Bcl-2蛋白表达水平，miR-29binhibitors显著升高Bcl-2蛋白表达水平，miR-29bmimics＋参芪扶正注射液组Bcl-2蛋白表达水平进一步降低。结合前期研究结果，参芪扶正注射液可以逆转Patu8988/ 5-Fu细胞的耐药性[11]，表明参芪扶正注射液通过调控miR-29b和Bcl-2表达，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，增加Patu8988/5-Fu细胞对化疗药物的敏感性，从而逆转肿瘤多药耐药。

综上所述，参芪扶正注射液可能通过调控miR-29b/Bcl-2通路从而逆转肿瘤多药耐药。miR-29b可能是参芪扶正注射液调控Patu8988/5-Fu耐药细胞Bcl-2表达的靶点，为深入研究参芪扶正注射液逆转胰腺癌MDR的作用机制提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突