4种中药注射剂改善大鼠慢性心力衰竭的药效研究

翟 优，刘思远，陈善夫，赵英强*

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046

2.北京中医药大学，北京 100029

3.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指慢性原发性心肌病变和心室因长期压力或容量负荷过重，心肌收缩力不能维持心排血量，心脏收缩时心室不能完全充盈和充分泵血导致的疾病[1]。CHF是多种心血管疾病不断发展的终末阶段，其发病率和死亡率较高，长时间的心功能障碍降低了患者的生存质量，给社会和家庭带来了沉重的经济负担[2-3]。目前临床上主要以β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂和利尿剂等改善心功能、延缓和抑制心肌重构，从而治疗CHF，但由于适应范围窄、安全系数低等问题，疗效不佳[4-5]。临床研究表明，中西药联用治疗CHF对于改善患者临床症状、提高远期疗效具有独特优势[6]。中药注射剂具有起效快、生物利用度高、无消化道吸收等特点，在辅助治疗CHF中已得到广泛认可[7]。

中医认为CHF属于“心悸”“水肿”“喘症”等范畴，病位在心，进而波及五脏，治则以“扶正祛邪”为主，因此补益类中药注射剂在CHF的治疗中得到广泛应用[8]。注射用益气复脉、生脉注射液、参麦注射液和参附注射液是以红参为君药，麦冬或附子为臣药的中药注射剂[9]，具有扩张冠脉、增加心肌供血、减少心肌耗氧量、去除氧自由基等药理作用，是临床治疗CHF过程应用较广泛的4种补益类中药注射剂[7,10-11]。因此，本研究选用以上4种中药注射剂，观察其改善大鼠CHF的疗效，为临床用药提供依据。

1 材料

1.1 动物

清洁级雄性Wistar大鼠100只，8周龄，体质量220～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。动物于温度（23±1）℃、湿度30%～40%、12 h明暗循环的环境中饲养，自由进食饮水。动物实验严格按照天津中医药大学动物伦理委员会标准执行（TCM-LAEC2020038）。

1.2 药品与试剂

生脉注射液（批号20032409，25 mL/支）、参附注射液（批号19120101001，10 mL/支）购自华润三九（雅安）药业有限公司；注射用益气复脉（冻干）（批号20190314）购自天津天士力之骄药业有限公司；参麦注射液（批号109027A1，10 mL/支）购自神威药业集团有限公司；卡托普利片（批号19103113，25 mg/片）购自中美上海施贵宝制药有限公司；异氟烷（批号045742）购自北京友诚嘉业生物科技有限公司；心钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）ELISA试剂盒（批号20200911-30882B）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）ELISA试剂盒（批号20200911-30639B）、和肽素（copeptin，CCP）ELISA试剂盒（批号20200911-30427B）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）ELISA试剂盒（批号20200911-34981B）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（批号20200911-34981B）、肌钙蛋白（troponin，Tn）ELISA试剂盒（批号20200911-35135B）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA试剂盒（批号20200911-35234B）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，CRP）ELISA试剂盒（批号20200911-30078B）购自上海酶联生物科技有限公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号20200724）购自南京建成生物工程研究所有限公司；盐酸（批号20200604）购自北京世纪科博科技发展有限公司；无水乙醇（批号20200522）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；Masson三色染色试剂盒（批号20190808）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器

VME2TM小动物麻醉机（美国Matrx公司）；M9彩色多普勒兽用超声诊断仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；ST16R离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite M200酶标仪（瑞士Tecan公司）；ASP300S全自动脱水机、EG1150H包埋机、RM2235切片机、HI1210展片机、HI1220烤片机（德国Lecia公司）；NIU显微镜（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 造模

取90只大鼠，采用冠状动脉左前降支结扎法制备大鼠CHF模型。用异氟烷麻醉剂行气体麻醉，顺肋间隙方向于肋骨左旁第3～4肋骨间撑开胸，暴露心脏，切开心包，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可见左冠状动脉前降支起始部位，用520线缝针穿过左冠壮动脉前降支，连同一小束心肌一起结扎，结扎后左心室壁变苍白，室壁运动减弱，彻底止血后逐层关胸，im抗生素。取10只大鼠作为对照组，仅将心脏外表面皮肤剪开后缝合，碘伏消毒。术后6周检测心功能，计算左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），将LVEF≤40%作为CHF模型成功的标志[12]。

2.2 分组与给药

将CHF大鼠随机分为模型组、注射用益气复脉（0.46 g/kg）组、生脉注射液（5.4 mL/kg）组、参附注射液（5.4 mL/kg）组、参麦注射液（5.4 mL/kg）组和卡托普利（3.67 mg/kg）组，每组15只。卡托普利溶于0.9%氯化钠溶液，配制成质量浓度为0.68 mg/mL的溶液；注射用益气复脉溶于0.9%氯化钠溶液，配制成质量浓度为0.08 g/mL的溶液。卡托普利组ig卡托普利溶液（5.4 mL/kg），其余各给药组尾iv相应药物（5.4 mL/kg），对照组和模型组尾iv等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续2周。

2.3 4种中药注射剂对CHF大鼠心功能的影响

给药结束后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，于左前胸锁骨下至肋骨下缘备皮，使用彩色多普勒兽用超声诊断仪进行超声心动图检查[13]。经多普勒超声心动图在B型超声左室长轴像引导下，于左室内径最大处（即乳头肌水平）显示M型超声图像，测量左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末容积、左室收缩末容积、左室二尖瓣舒张期E峰和A峰，计算LVEF、左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和E/A，进行心功能分析。

2.4 4种中药注射剂对CHF大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平的影响

给药结束后，大鼠腹主动脉取血5 mL，室温静置30 min，3000 r/min离心20 min，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、LDH、IL-6和CRP水平。

2.5 4种中药注射剂对CHF大鼠心脏组织病理变化的影响

给药结束后，大鼠腹主动脉放血处死，暴露胸腔，取出完整的心脏组织，于10%甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，切片（4～5 μm）后脱水，进行HE染色，于显微镜下观察心脏组织病理变化。

心脏组织切片按照Masson染色试剂盒说明书进行染色，胶原组织呈蓝色，正常组织呈红色，于显微镜下观察心脏组织纤维化或胶原沉积程度。

2.6 统计学方法

数据以±s表示，采用统计软件Graphpad prism 8.0进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 4种中药注射剂对CHF大鼠心功能的影响

如图1和表1所示，给药后，与对照组比较，模型组大鼠心脏LVFS、LVEF、E/A均显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠心脏LVFS、LVEF、E/A均显著升高（P＜0.01），表明注射用益气复脉、生脉注射液、参麦注射液、参附注射液、卡托普利能够改善CHF大鼠心脏的射血能力和收缩能力。

表1 4种中药注射剂对CHF大鼠心功能的影响Table 1 Effect of four kinds of traditional Chinese medicine injections on heart function of CHF rats

图1 4种中药注射剂对CHF大鼠心功能的影响Fig.1 Effect of four kinds of traditional Chinese medicine injections on heart function of CHF rats

3.2 4种中药注射剂对CHF大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平均显著升高（P＜0.01），表明大鼠出现心衰症状和炎性反应；与模型组比较，注射用益气复脉组大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平均显著降低（P＜0.05、0.01），参麦注射液组和参附注射液组大鼠血清中BNP、CCP、IL-6和CRP水平显著降低（P＜0.05、0.01），卡托普利组大鼠血清中BNP、CCP和IL-6水平显著降低（P＜0.05），生脉注射液组各指标呈降低趋势，表明4种中药注射剂可以不同程度地改善CHF大鼠的心脏功能和炎性反应，其中注射用益气复脉效果最佳。

表2 4种中药注射剂对CHF大鼠血清中ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、IL-6、CRP和LDH水平的影响Table 2 Effect of four kinds of traditional Chinese medicine injections on levels of ANP, BNP, CCP, Tn, CK-MB, IL-6, CRP and LDH in serum of CHF rats

3.3 4种中药注射剂对CHF大鼠心脏组织病理变化的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠左心室心肌细胞排列紊乱，心肌细胞肥大，胞质肿胀，部分心肌细胞核宽大畸形，心肌细胞间质增加，炎性细胞浸润；各给药组上述病理变化明显改善。如图3所示，模型组大鼠左心室纤维组织增生，左心室壁极薄，多数心肌细胞为纤维组织替代；与模型组相比，各给药组大鼠心肌纤维化面积减少，其中注射用益气复脉、生脉注射液、参麦注射液优于参附注射液。

图2 4种中药注射剂对CHF大鼠心脏组织病理变化的影响 (HE, ×100)Fig.2 Effect of four kinds of Chinese medicine injections on pathological changes of heart tissue in CHF rats (HE, × 100)

图3 4种中药注射剂对CHF大鼠心脏组织病理变化的影响 (Masson, ×100)Fig.3 Effect of four kinds of Chinese medicine injections on pathological changes of heart tissue in CHF rats (Masson, × 100)

4 讨论

心功能是指心脏的泵血机能。心脏即心泵，是推动血液循环的动力器官，通过其有规律的收缩和舒张，可将静脉回心的血液射入动脉，维持一定的心输出量和动脉血压，保证身体各组织器官的血液循环[14]。LVFS、LVEF、E/A是衡量心功能的重要指标，其中LVFS和LVEF是反映左心室收缩功能的常见参数，E/A是反映心脏舒张功能的评价指标[15]。本研究通过超声心动图检测发现各给药组大鼠LVFS、LVEF、E/A均显著升高，表明注射用益气复脉、生脉注射液、参麦注射液、参附注射液均可以显著改善CHF大鼠心脏的射血能力、舒张和收缩能力，缓解心功能障碍，可能与4种补益类中药注射剂均以红参为君药，且其中的人参皂苷成分具有保护血管内皮细胞、抗炎、抗凋亡、增加血管灌流量等作用相关[16-17]。

血液中BNP、ANP、CCP、Tn、CK-MB、LDH水平与临床患者心衰的严重程度呈正相关[18]，左室壁的张力调节影响BNP分泌。BNP与肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活呈拮抗作用，ANP是由心房合成、贮存和分泌的活性多肽，具有利尿、舒张血管、降低血压和对抗肾素-血管紧张素系统和抗利尿激素作用，能够反映心脏衰竭的严重程度。此外，心力衰竭导致缺血心肌细胞中线粒体功能障碍，促进活性氧生成，诱导氧化应激，增加坏死、凋亡、纤维化和能量代谢异常[19-20]，从而导致心肌细胞损伤，血液中Tn、LDH和CK-MK水平显著升高[21-22]。本研究发现注射用益气复脉、生脉注射液、参麦注射液、参附注射液均能够降低ANP、BNP、CCP、Tn、CK-MB、LDH水平，其中注射用益气复脉对各指标的改善作用明显优于其他3种补益类中药注射剂。与参麦注射液和参附注射液相比，注射用益气复脉组方中具有五味子，五味子中五味子乙素、五味子丙素、五味子中总木脂素及五味子醇乙等成分均能够通过促进新生血管生成、抗炎和抗氧化等途径发挥保护心脏和血管的作用[23]。且有研究表明注射用益气复脉中的红参、麦冬和五味子均为有效成分，且五味子对心功能和心肌酶等指标均有改善作用[24]。

心脏功能受损可以使心脏炎性反应增加，炎性细胞释放大量炎性介质，继而引起心肌细胞凋亡和坏死，CRP和IL-6是评价炎性反应的重要指标[25]。本研究结果显示，注射用益气复脉、参麦注射液和参附注射液能够不同程度地降低心肌的炎性反应；HE染色结果显示，4种补益类中药注射剂均能够缓解CHF大鼠心脏左室炎性浸润程度。心衰早期阶段的炎症过程中核因子-κB（nucleaur factor-κB，NF-κB）被激活[26]，后续本课题组将对4种补益类中药注射剂通过调节NF-κB信号通路抑制炎性反应的关系进行深入研究，进一步明确其抑制炎症的作用机制。

CHF导致的心肌损伤后，在缺血区域周围形成缺血瘢痕，I型和III型胶原合成和降解不平衡，导致心肌纤维化，心肌的纤维化涉及心脏重塑，是典型的代偿性肥厚或重塑过程[27-29]。Masson染色结果显示，生脉注射液、参麦注射液、参附注射液及注射用益气复脉能够显著降低CHF大鼠心脏的纤维化程度，HE染色结果也表明4种中药注射剂明显改善心肌细胞肥大、胞浆肿胀，炎性浸润等病理变化，其具体如何缓解心肌组织的病理变化还有待于进一步研究。

综上所述，4种补益类中药注射剂均能够显著提高CHF大鼠的心功能指标，降低心肌损伤指标和炎性因子水平，减轻心肌纤维化程度，但4种中药注射剂在改善心功能及心肌损伤方面的疗效略有差异，可能与组方、作用机制等方面相关，后续本课题组将对其组方、作用机制差异等方面进行深入研究和验证，进一步明确造成4种补益类中药注射剂药效学差异的原因。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突